Rsk kötési reakció. Mikrobiológia mikrobiológiai kutatási technikákkal - komplementkötési reakció. Komplementer reakciók

Szinte minden fertőző betegség laboratóriumi diagnosztikája azon antitestek azonosításán alapul, amelyek a beteg vérében szerológiai reakciók segítségével képződnek a kórokozó antigének ellen. A tizenkilencedik század végétől a huszadik század elejéig léptek be az orvosi gyakorlatba.

A tudomány fejlődése segített meghatározni a mikrobák antigén szerkezetét és méreganyagaik kémiai képletét. Ez lehetővé tette nemcsak terápiás, hanem diagnosztikai szérumok létrehozását is. Úgy nyerik őket, hogy legyengített kórokozókat juttatnak a laboratóriumi állatokba. Több napos inkubáció után nyulak vagy egerek véréből olyan készítményeket készítenek, amelyeket szerológiai tesztek segítségével a mikrobák vagy toxinjaik azonosítására használnak.

Az ilyen reakció külső megnyilvánulása a termelés körülményeitől és a páciens vérében lévő antigének állapotától függ. Ha a mikrobiális részecskék oldhatatlanok, kicsapódnak, lizálnak, megkötődnek vagy immobilizálódnak a szérumban. Ha az antigének oldhatók, akkor a semlegesítés vagy a kicsapódás jelensége következik be.

Agglutinációs reakció (RA)

A szerológiai agglutinációs reakció nagyon specifikus. Egyszerűen kivitelezhető és elég látványos ahhoz, hogy gyorsan meghatározzuk az antigének jelenlétét a páciens vérszérumában. A Widal-reakció (tífusz és paratífusz diagnózisa) és a Weigl-reakció (tífusz-láz) végrehajtására szolgál.

A humán antitestek (vagy agglutininek) és a mikrobiális sejtek (agglutenogének) közötti specifikus kölcsönhatáson alapul. Kölcsönhatásuk után részecskék képződnek, amelyek kicsapódnak. Ez pozitív jel. Élő vagy elölt mikrobiális ágensek, gombák, protozoonok és szomatikus sejtek használhatók a reakció végrehajtására.

Kémiailag a reakció két szakaszra oszlik:

1. Az antitestek (AT) specifikus kombinációja antigénekkel (AG).
2. Nem specifikus - AG-AT konglomerátumok kicsapódása, azaz agglutinát képződése.

Közvetett agglutinációs reakció (IAR)

Ennek végrehajtásához tisztított birka eritrocitákat és emberi vörösvértesteket használnak, amelyeket antitestekkel vagy antigénekkel előkezeltek (ez attól függ, hogy pontosan mit akar találni a laboráns). Egyes esetekben az emberi vörösvérsejteket immunglobulinokkal kezelik. Az eritrociták szerológiai reakciói akkor tekinthetők sikeresnek, ha leülepednek a cső alján. Pozitív reakcióról akkor beszélhetünk, ha a cellák fordított esernyő formájában helyezkednek el, és elfoglalják a teljes alját. Negatív reakciót számolunk, ha a vörösvértestek egy oszlopban vagy gomb formájában helyezkednek el az alsó rész közepén.

Kicsapódási reakció (RP)

Az ilyen típusú szerológiai teszteket az antigének rendkívül kis részecskéinek kimutatására használják. Ezek lehetnek például fehérjék (vagy azok részei), fehérjék lipidekkel vagy szénhidrátokkal alkotott vegyületei, baktériumok részei és toxinjaik.

A reakcióhoz szükséges szérumot állatok, általában nyulak mesterséges megfertőzésével nyerik. Ezzel a módszerrel abszolút bármilyen kicsapó szérumot kaphat. A szerológiai precipitációs reakciók kialakulása hatásmechanizmusában hasonló az agglutinációs reakciókhoz. A szérumban lévő antitestek antigénekkel kombinálva nagy fehérjemolekulákat képeznek, amelyek a cső alján vagy a szubsztrátumon (gél) rakódnak le. Ez a módszer nagyon specifikusnak tekinthető, és akár kis mennyiségű anyagot is képes kimutatni.

Pestis, tularémia, lépfene, agyhártyagyulladás és más betegségek diagnosztizálására használják. Emellett igazságügyi orvosszakértői vizsgálatban is részt vesz.

gélben

A szerológiai reakciók nemcsak folyékony közegben, hanem agargélen is végrehajthatók. Ezt diffúz kicsapásos módszernek nevezik. Komplex antigénkeverékek összetételének tanulmányozására használják. Ez a módszer az antigének antitestekkel szembeni kemotaxisán alapul, és fordítva. A gélben különböző sebességgel haladnak egymás felé, és találkozva csapadékvonalakat alkotnak. Minden sor egy AG-AT készlet.

Exotoxin semlegesítési reakció antitoxinnal (RN)

Az antitoxikus szérumok semlegesíthetik a mikroorganizmusok által termelt exotoxinok hatását. Ezek a szerológiai reakciók ezen alapulnak. A mikrobiológia ezt a módszert használja a szérumok, toxinok és toxoidok titrálására, valamint terápiás aktivitásuk meghatározására. A toxinsemlegesítés erősségét a hagyományos mértékegységek - AE - határozzák meg.

Ezenkívül ennek a reakciónak köszönhetően meghatározható az exotoxin fajtája vagy típusa. Ezt diftériára, botulizmusra használják. A vizsgálat „üvegen” és gélben is elvégezhető.

Lizis reakció (RL)

A páciens szervezetébe bekerülő immunszérum fő funkciója, a passzív immunitás mellett lizáló tulajdonságokkal is rendelkezik. Képes feloldani a mikrobiális ágenseket, idegen sejtelemeket és a páciens szervezetébe kerülő vírusokat. A szérumban lévő antitestek specifitásától függően bakteriolizineket, citolizineket, spirocetolizineket, hemolizineket és másokat izolálnak.

Ezeket a specifikus antitesteket "komplementnek" nevezik. Az emberi test szinte minden folyadékában megtalálható, összetett fehérjeszerkezettel rendelkezik, rendkívül érzékeny a megnövekedett hőmérsékletre, rázásra, savakra és közvetlen napfényre. De szárítva akár hat hónapig is megőrzi lizáló tulajdonságait.

Az ilyen típusú szerológiai reakcióknak a következő típusai vannak:

bakteriolízis;

Hemolízis.

A bakteriolízist a páciens vérszérumával és élő mikrobákkal végzett specifikus immunszérummal végezzük. Ha elegendő mennyiségű komplement van jelen a vérben, a kutató a baktériumok lízisét fogja látni, és a reakció pozitívnak minősül.

A második szerológiai vérreakció az, hogy a páciens vörösvérsejtjeinek szuszpenzióját hemolizin tartalmú szérummal kezelik, amelyek csak bizonyos bók jelenlétében aktiválódnak. Ha van ilyen, a laboráns megfigyeli a vörösvértestek feloldódását. Ezt a reakciót széles körben alkalmazzák a modern gyógyászatban a komplement titerének meghatározására (vagyis annak legkisebb mennyiségére, amely a vörösvértestek lízisét provokálja) a vérszérumban és komplementkötési teszt elvégzésére. Ily módon történik a szifiliszre adott szerológiai reakció -

Komplement rögzítési reakció (CFR)

Ezt a reakciót a fertőző ágens elleni antitestek kimutatására használják a páciens vérszérumában, valamint a kórokozó azonosítására antigén szerkezete alapján.

Eddig a pontig egyszerű szerológiai reakciókat írtunk le. Az RSC összetett reakciónak számít, hiszen nem két, hanem három elem lép kölcsönhatásba benne: antitest, antigén és komplement. Lényege abban rejlik, hogy az antitest és az antigén közötti kölcsönhatás csak komplement fehérjék jelenlétében jön létre, amelyek a létrejövő AG-AT komplex felületén adszorbeálódnak.

Maguk az antigének a komplement hozzáadása után jelentős változásokon mennek keresztül, ami az elvégzett reakció minőségét jelzi. Ez lehet lízis, hemolízis, immobilizáció, baktericid vagy bakteriosztatikus hatás.

Maga a reakció két fázisban megy végbe:

1. A kutató számára vizuálisan nem észrevehető antigén-antitest komplex kialakulása.
2. Az antigén változása a komplement hatására. Ez a fázis leggyakrabban szabad szemmel is megfigyelhető. Ha a reakció vizuálisan nem látható, akkor egy további indikátorrendszert használnak a változások azonosítására.

Jelzőrendszer

Ez a reakció a komplementkötésen alapul. A tisztított birka eritrocitákat és a komplementet nem tartalmazó hemolitikus szérumot egy órával az RSC felhelyezése után adjuk a kémcsőbe. Ha kötetlen komplement marad a kémcsőben, az csatlakozik a birkavérsejtek és a hemolizin között képződő AG-AT komplexhez, és azok feloldódását okozza. Ez azt jelenti, hogy az RSC negatív. Ha a vörösvértestek érintetlenek maradnak, akkor a reakció pozitív.

Hemagglutinációs reakció (HRA)

Két alapvetően eltérő hemagglutinációs reakció létezik. Az egyik szerológiai, vércsoportok meghatározására szolgál. Ebben az esetben a vörösvértestek kölcsönhatásba lépnek az antitestekkel.

A második reakció pedig nem szerológiai, mivel a vörösvérsejtek reagálnak a vírusok által termelt hemagglutininekkel. Mivel az egyes kórokozók csak meghatározott vörösvértestekre (csirke, bárány, majom) hatnak, ez a reakció nagyon specifikusnak tekinthető.

A kémcső alján lévő vérsejtek elhelyezkedése alapján megállapíthatja, hogy a reakció pozitív vagy negatív. Ha a mintázatuk egy fordított esernyőhöz hasonlít, az azt jelenti, hogy a kívánt vírus jelen van a páciens vérében. És ha az összes vörösvérsejt úgy képződik, mint egy érmeoszlop, akkor a kívánt kórokozók nem léteznek.

Hemagglutinációs gátlási reakció (HAI)

Ez egy nagyon specifikus reakció, amely lehetővé teszi a vírusok típusának, típusának vagy specifikus antitestek jelenlétének meghatározását a páciens vérszérumában.

Lényege abban rejlik, hogy a vizsgálati anyaggal együtt kémcsőbe juttatott antitestek megakadályozzák az antigének lerakódását a vörösvértesteken, ezáltal megállítják a hemagglutinációt. Ez annak minőségi jele, hogy a vérben a keresett specifikus antigének vannak jelen.

Immunfluoreszcens reakció (RIF)

A reakció az AG-AT komplexek kimutatásának képességén alapul, miután azokat fluorokróm festékekkel kezelték. Ez a módszer könnyen használható, nem igényli a tiszta tenyészet izolálását és kevés időt vesz igénybe. A fertőző betegségek gyors diagnosztizálásához nélkülözhetetlen.

A gyakorlatban ezek a szerológiai reakciók két típusra oszthatók: közvetlen és közvetett.

A közvetlen RIF-et fluoreszcens szérummal előkezelt antigénnel állítják elő. A közvetett pedig az, hogy a gyógyszert először hagyományos, a kívánt antigéneket tartalmazó diagnosztikával kezelik, majd ismét lumineszcens szérumot alkalmaznak, ami az AG-AT komplex fehérjéire jellemző, és a mikrobasejtek észrevehetővé válnak. mikroszkópia.

Az RSC külön előnye, hogy a benne szereplő antigén természete (korpuszkuláris vagy oldható) nem mindegy, mivel a komplement bármely IgG-vel és IgM-mel rokon antitest Fc-fragmenséhez kötődik, függetlenül annak antitestspecifitásától. Ezenkívül az RSA nagyon érzékeny: lehetővé teszi az antitestek mennyiségének 10-szer kisebb kimutatását, mint például a precipitációs reakcióban. Az RSC-t 1901-ben javasolta J. Bordet és O. Zhang. A komplement két tulajdonságán alapul:

1) az „antigén + antitest” komplexhez való kötődés képessége;

2) a hemolitikus szérum előállításához használt vörösvértestek lízise.

Az RSK-t két szakaszban hajtják végre, és két rendszer vesz részt benne - kísérleti vagy diagnosztikai és indikátor. A diagnosztikai rendszer egy teszt (vagy diagnosztikai) szérumból áll, amelyet 56 °C-on 30 percig melegítenek a reakció végrehajtása előtt, hogy inaktiválják a benne lévő komplementet és antigént.

A rendszer szabványos kiegészítéssel egészül ki. Forrása friss vagy szárított tengerimalac tejsavó. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. Ha a tesztszérum antitesteket tartalmaz, azok kölcsönhatásba lépnek a hozzáadott antigénnel, és az így létrejövő „antigén + antitest” komplexek megkötik a hozzáadott komplementet. Ha a szérumban nincsenek antitestek, az antigén + antitest komplex képződése nem következik be, és a komplement szabad marad.

A reakció ezen szakaszában általában nincsenek látható megnyilvánulásai a komplementkötésnek. Ezért annak tisztázására, hogy megtörtént-e a komplementkötés vagy sem, egy második indikátorrendszert (inaktivált hemolitikus szérum + juh vörösvértestek) adunk hozzá, és az összes RSC komponens keverékét ismét 37 °C-on 30-60 percig inkubáljuk. , amely után a reakció eredményeit értékeljük. Egy okostelefon segítségével (mint ez) kiszámolhatja a pontos reakcióidőt. Ha a komplement kötődik az első szakaszban, a diagnosztikai rendszerben, azaz antitestek vannak a páciens szérumában, és a komplementet az „antitest + antigén” komplex köti, akkor nem megy végbe a vörösvértestek lízise - a vörösvértestek pozitívak: a folyadék színtelen, a cső alján vörösvértestek üledék található

Ha a szérumban nincsenek specifikus antitestek és a diagnosztikai rendszerben nem történik komplementkötés, azaz az RSC negatív, akkor a diagnosztikai rendszerben el nem használt komplement kötődik az indikátorrendszer „vörösvértestek + antitestek” komplexéhez, ill. hemolízis történik: a kémcsőben „lakkozott vér” nincs vörösvérsejt üledék. Az RSC intenzitását négykeresztes rendszerrel értékeljük a hemolízis késleltetés mértékétől és az eritrocita üledék jelenlététől függően. A reakciót megfelelő kontrollok kísérik: szérumkontroll (antigén nélkül) és antigénkontroll (szérum nélkül), mivel egyes szérumok és egyes antigének anti-komplementer hatásúak. Az RSC elvégzése előtt az abban részt vevő összes komponenst – a tesztszérum vagy az antigén kivételével – gondos titrálásnak kell alávetni.

Különösen fontos a komplement pontos adagolása a reakcióba, mivel annak hiánya vagy feleslege téves eredményekhez vezethet. A komplementtiter az a minimális mennyiség, amely egy munkadózis hemolitikus szérum jelenlétében biztosítja a vörösvértestek teljes feloldódását. A fő kísérlet elvégzéséhez a megállapított titerhez képest 20-25%-kal megnövelt adagot kell bevenni. A hemolitikus szérum titere a maximális hígítása, amely azonos térfogatú 10% -os komplementoldattal keverve 37 ° C-on 1 órán belül teljesen hemolizálja a vörösvértestek megfelelő dózisát.

Az indirekt hemolízis reakciót gyorsított módszerként alkalmazzák specifikus antitestek kimutatására. A vörösvérsejteket antigének hordozójaként használják. Ha a beteg szérumában specifikus antitestek vannak, az érzékeny vörösvérsejtek komplement jelenlétében lizálódnak.

A komplementkötési reakció az, hogy egy antigén és a megfelelő antitest kombinációja friss szérumból extrahálódik, és szilárdan megtartja (megköti) a komplementet abban. Az antitestek kimutatására és az antigének természetének meghatározására használják. Az antigén és a szérum közötti specifikus affinitás hiányában a komplement adszorpciója nem történik meg.
A reakció végrehajtásához a következő összetevőkre van szükség:
- 3 vagy 5% birka eritrocita szuszpenzió;
- hemolitikus szérum a hármas titerének megfelelő dózisban;
- komplement titrálással megállapított dózisban; egy antigén, amely önállóan nem okoz sem hemolízist, sem annak késleltetését, titrálással megállapított dózisban;
- 56°C-on 15-30 percig vízfürdőben aktivált, 1:5 vagy 1:10 arányban hígított tesztszérum; steril sóoldat (0,85%).
A juh vörösvértestjei. A birka vörösvértesteit a reakció előestéjén nyerik a kos jugularis vénájának aszeptikus körülmények között, kanül segítségével történő átszúrásával. A vért üveggyöngyöket tartalmazó steril tégelybe gyűjtik, amelyeket 10-15 percig rázással defibrálnak. Ezt követően a vért több réteg gézen átszűrjük, és a vörösvértesteket háromszor mossuk sóoldatban centrifugában. A mosófolyadék utolsó adagjának színtelennek kell lennie.
A reakció beállításához 1-3%-os eritrocita szuszpenziót használnak, amelyet 1 ml mosott vörösvértest üledékből + 33 ml fiziológiás oldatból készítenek. A vörösvérsejtek a hűtőszekrényben öt-hat napig tárolhatók. Hosszabb tároláshoz a következő összetételű Ringer-Locke folyadékban mossák: NaCl - 9,0 g, KCl - 0,2 g, CaCl2 - 0,2 g, NaHCO3 - 1,0 g 1 liter desztillált vízben. A folyadékot 30 percig gőzzel sterilizáljuk, majd 10 g kristályos bórsavat adunk hozzá. Ez a folyadék két-három hétig eltartható a gleccseren.
A vörösvértesteket formalinnal is megőrizheti, ha 10 ml vörösvérsejt üledékhez 1 ml formalin oldatot ad a következő összetétellel: 4 ml 40%-os formalin 200 ml fiziológiás oldathoz.
Hemolitikus szérum. A hemolitikus szérum előállításához a nyulakat három-négy alkalommal intravénásan fecskendezik be 50%-os, egyenként 2-5 millió birka vörösvértest-szuszpenzióval, két-három napos időközönként. Az immunizálás befejezését követő hatodik vagy hetedik napon ellenőrizzük a szérumtitert. Ha nem alacsonyabb, mint 1:1200, akkor az állat szívéből vagy a fül széli vénájából vért vesznek. 55°C-os vízfürdőben 30 percig végzett inaktiválás után a savót 1%-os száraz bórsav hozzáadásával tartósítják. A tejsavó tartósításához használhat azonos térfogatú steril glicerint, 180 °C-on 15 percig melegítve, vagy adjon hozzá 1 ml keveréket 9 ml ilyen összetételű savóhoz - 5,5 ml karbolsav + 20 ml glicerin + 74,5 ml desztillált vízből. Használhat 0,05%-os kinozolt is. A szérumot zárt csövekben, jégszekrényben kell tárolni.
A hemolitikus szérum titerét a következő séma szerint határozzuk meg.

BAN BEN A reakció két jelenségen alapul - a bakteriolízisen és a hemolízisen. A komplement részt vesz a megnyilvánulásukban. Ezért az RSC-ben két komponensrendszert használnak: 1) biztosítja a bakteriolízis jelenségét, és diagnosztikai célokra használják; 2) hemolitikus, indikátor, segédanyag; lehetővé teszi annak meghatározását, hogy a komplement kötött-e vagy sem az első rendszerben (lásd színséma, I. ábra). Korábban a baktériumok szuszpenzióját használták antigénként, ezért az első rendszert bakteriolitikusnak nevezték (pozitív esetekben a baktériumok lízise történt).

Az RSC felállítása két szakaszban történik. Az első szakaszban bakteriolitikus rendszert készítenek: 0,5 ml tesztszérumot antigénnel keverünk össze kémcsövekben, és komplementet adunk hozzá szigorúan meghatározott dózisban (titerben). Az antigén-szérum-komplement keveréket (bakteriolitikus rendszer) vízfürdőben (vagy termosztátban) 20...40 percig 37...38 "C-on tartjuk. A kémcsőben lévő komponensek kölcsönhatásának eredménye: láthatatlan, a folyadék átlátszó és színtelen marad. Ha komplement van a bakteriolitikus rendszerben, akkor a reakció második szakasza megy végbe: a hemolitikus rendszer komponenseit adjuk a kémcsövekhez - mosott birka eritrocitákat és inaktivált hemolitikus szérumot. A kémcsőben a bakteriolitikus rendszer összes komponensét összerázzuk, és 37...38 °C-os vízfürdőbe helyezzük 20...40 percre. Ezután hozzáadjuk a hemológiai rendszer összetevőit, mindent újra és újra 10...15 percre vízfürdőbe helyezünk.

Az eredmény előzetes elszámolása. Ha a szérumot beteg állatból nyerik, akkor olyan antitesteket tartalmaz, amelyek egy specifikus antigénnel kombinálódnak. A komplement ehhez a komplexhez kötődik (antigén - antitest) - hemolízis nem történik, az eredmény pozitív.

Egészséges állat szérumában nincsenek antitestek: az antigén-antitest komplex nem képződik, a komplement nem kötődik a bakteriológiai rendszerben. Amikor vörösvértesteket és hemolizint adunk hozzá (ez egy antigén és egy antitest között van), a komplement reagál ezzel a komplexszel - hemolízis történik, az eredmény negatív (lásd a színt II. ábra).

Az eredmény végleges elszámolása. A kémcsöveket 15...20 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk, ha a bakteriolitikus rendszerben lévő szérum beteg állatból származott, akkor a kémcsőben specifikus antigén-antitest komplex képződik, amely adszorbeálja (megköti) az összes hozzáadott anyagot. kiegészítés. Következésképpen a második, hemolitikus rendszerben nem megy végbe hemolízis, a vörösvértestek leülepednek a kémcső aljára, és a felülúszó folyadék átlátszó lesz. Az RSC eredménye pozitív.

Ha a vizsgált szérum nem tartalmaz specifikus antitesteket a felhasznált antigénre (azokban az esetekben, amikor a szérum egészséges állatból származik), akkor az antigén-antitest komplex nem képződik a bakteriolitikus rendszerben, és ezért a komplement nem adszorbeálódik ebben a rendszerben, de szabad marad. A hemolitikus rendszer komponenseinek hozzáadásakor (a reakció második fázisában) a komplement kölcsönhatásba lép a második komplexszel (hemolizin - vörösvérsejtek), a vörösvértestek hemolízise megtörténik - nem képződik csapadék, a kémcsőben lévő folyadék lakkvörös színű. Az RSC eredménye negatív.

RSK. használják: 1) specifikus antitestek kimutatására egy beteg állat szérumában (brucellózis, peripneumonia, takonykór, leptospirosis, trypanosomosis stb. diagnosztizálására); 2) specifikus antigén (bakteriális vagy vírus) azonosítása a vizsgálati anyagban specifikus immunszérum jelenlétében.

Az RSC elvégzéséhez szükséges: kutatásra kapott szérumminták; két ismerten pozitív szérum (standard, pozitív eredményt ad), és két normál szérum. Minden 1:10 arányban hígított szérumot inaktiválunk 56...58 °C-on 30 percig; titer szerint hígított antigén; komplement hígítva a megállapított titernek megfelelően bakteriolitikus rendszerben történő titrálás során; hemolizin a munkatiterben; juh vörösvértestek (I: 40); sóoldat, beosztásos pipetták, kémcsövek, állványok, 37...38 °C-os vízfürdő.

Az RSC elvégzése előtt a birkavért defibrináljuk, a vörösvértesteket centrifugálással sóoldattal mossuk, amíg a felülúszó teljesen átlátszóvá nem válik, amelyet leszívással eltávolítanak, és a kicsapódott vörösvértesteket sóoldattal 1:40 (2,5%) hígítjuk. . Az antigént a biogyár a címkén feltüntetett titernek megfelelően hígítja. A hemolizin és a komplement titrálása az RSC felhelyezése előtt történik.

Az RSC antigénjét biogyárakban állítják elő. Általában ezek elpusztult mikrobaszuszpenziók (vagy vírustartalmú szövetek) kivonatai. Az antigéneknek nem lehet hemolizáló hatása, amit a reakció folyamata során szabályozunk (1...2 adag antigént és 0,5 ml vörösvérsejt-szuszpenziót öntünk egy kémcsőbe: ne legyen hemolízis). Az antigént tartalmazó ampullán a biogyár jelzi, hogy RSC-re (sapnaya, brucellosis vagy egyéb) szánják. A csomagolódobozon fel van tüntetve az antigén tételszáma, gyártási dátuma, lejárati ideje, aktivitása, vagyis milyen hígításban kell használni az RSC elvégzésekor (1:100, 1:150 stb.). Egyes betegségekben más anyagok szolgálnak antigénként; például szarvasmarhák peripneumonia diagnosztizálásához a CSC antigénje egy kísérletileg szubkután vagy intrapleurálisan fertőzött borjú nyirokcsomója. Az antigének hosszú távú tárolása során a titerüket egy speciális titrálási séma segítségével a laboratóriumban ismét ellenőrizzük.

A kutatásra kapott tesztszérumokat fiziológiás oldattal 1:5 vagy 1:10 arányban hígítják, vízfürdőben hevítve inaktiválják, hogy 56...58 °C-on 30 percig elpusztítsák saját komplementjüket (szamarak, öszvérek, szalonkafélék széruma - 61 °C-on).

A hemolizint biogyárakban állítják elő, nyulakat mosott birka vörösvértestekkel hiperimmunizálásával. Ehhez 2...3 napos időközönként 4...5 alkalommal 40...50%-os vörösvértest-szuszpenziót adnak a nyulaknak intravénásan. Az utolsó injekció után egy héttel vért vesznek a nyulakból, a szérumot sterilen leszívják, inaktiválják, glicerinnel 1:1 vagy 0,5%-os fenollal tartósítják, titrálják és ampullákba töltik. Laboratóriumokban a szakaszolás előtt az RSC-t ismét titrálják.

Hemolizin titrálási séma. El kell készíteni: i) komplement hígítás 1:20; 2) hemolizin 1:100 (0,2 ml hemolizin + 9,8 ml sóoldat); 3) birka vörösvértesteinek szuszpenziója 1:40; 4) fiziológiás NaCl-oldat.

A titrálási reakció beállításához két csősort helyezünk egy állványra – az egyik segédanyagot csak a hemolizin hígítások elkészítéséhez, a másikat a titráláshoz. Minden sor első csövéhez 1:100 kezdeti hemolizinhígítást adunk, majd sorozathígításokat készítünk. Minden kémcsövet felrázunk, és 10...15 percre 37...38°C-os vízfürdőbe helyezzük. Az eredmény számítása: ebben a példában a legkisebb mennyiség (vagy annak legnagyobb hígítása), amely teljes hemolízist eredményezett, 1:2000, azaz ez a tényleges titere. A munkatiter 2-szer koncentráltabb - 1:1000.

Az első sor kémcsövéből származó minden egyes hígításból 0,5 ml-t (nyilakkal jelölve) átviszünk a második sor különálló kémcsövébe. Adjon 0,5 ml komplementet (1:20), 0,5 ml juh vörösvértestet (2,5%-os szuszpenzió vagy 1:40) és 1 ml sóoldatot a második sor összes kémcsőébe úgy, hogy a folyadék térfogata minden kémcső 2,5 ml volt.

Jegyzet. Abból a tényből kiindulva, hogy az RSC végső készítménye 5, egyenként 0,5 ml-es komponensből áll, amelyek 2,5 ml térfogatot tesznek ki, ez a térfogat a teljes munka során megmarad.

A kémcsöveket összerázzuk és 10...15 percre vízfürdőbe helyezzük. A hemolízis elsősorban magas hemolizin tartalmú kémcsövekben történik (a legalacsonyabb hígítása 1:500, 1:1000...). A legkisebb mennyiségű hemolizin (legnagyobb hígítása), amely adott körülmények között a vörösvértestek teljes hemolízisét okozta, ún. limit (tényleges) titer hemolizin. A további munkához a hemolizin 2-szer koncentráltabban, azaz dupla mennyiségben, kétszeres titerben kerül felhasználásra, amit ún. munkacím. Például, ha a tényleges titer I: 2500 (vagy 1: 2000), akkor a munkatiter 1:1250 (vagy 1: W00) hígításnak felel meg.

A komplement különböző állatfajok (és emberek) friss szérumának, nyirokrendszerének, szövetnedveinek összetevője; felfedezte Buchner (1889). A rovarokban nincs kiegészítő. A komplement összetett szerkezetű fehérjeanyag, amely gyorsan inaktiválódik hevítés, hosszú távú tárolás, ultraibolya sugárzás, erős rázás, kerámiaszűrőkön való szűrés, kaolin, savak, lúgok, alkohol, aceton, kloroform, desztillált hozzáadásával. víz, szuszpendált baktériumok stb. A komplement tartósítható 5 g nátrium-szulfát és 4 g bórsav hozzáadásával 100 ml tengerimalac szérumhoz. A kiegészítő tevékenység legfeljebb hat hónapig tart. A befőzés legjobb módja a vákuum alatti szárítás alacsony hőmérsékleten (liofilizálás). Lezárt ampullákban ebben az állapotban két évig eláll. Minden egyes RSC-eljárás előtt titrálással ellenőrzik a komplementaktivitást, azaz meghatározzák a titerét - az adott reakcióhoz szükséges optimális mennyiséget. A komplementet kétszer titrálják: hemolitikus és bakteriolitikus rendszerekben.

Mert komplement titrálása a hemolitikus rendszerben készítse elő a komponenseket: komplement 1:20 hígításban (1 ml komplement + 19 ml sóoldat); hemolizin, a munkatiternek megfelelően hígítva; mosott birka vörösvértestének szuszpenziója (1:40), fiziológiás oldat. A kémcsöveket állványra helyezzük, és 0,03 ml-es (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: 0,43 ml-ig) beosztásos pipettával különböző mennyiségű komplementet öntünk bele. Ezután adja hozzá a többi komponenst (57. ábra). Minden kémcsövet összerázunk, és 10...15 percre 37...38 °C-os vízfürdőbe helyezzük, majd az eredményt feljegyezzük.

Az eredmény számítása: a komplement titerének a legkisebb mennyiségű komplementet vesszük, amely biztosítja a teljes hemolízist (ebben a példában - 0,25 ml).

A titrálási eredményt a legmagasabb komplementtartalmú kémcsövekben kezdik figyelembe venni, ahol elsősorban hemolízis várható. Azt a legkisebb mennyiségű komplementet, amely adott körülmények között biztosítja a vörösvértestek teljes hemolízisét, ún komplement titer a hemolitikus rendszerben.

Mert komplement titrálása a bakteriolitikus rendszerben szükséges, hogy a reakció összes összetevője legyen: komplement (1:20), vörösvértestek (1:40), hemolizin a munkatiterben, két pozitív és két normál szérum, egy specifikus antigén. A szérumokat sóoldattal 1:10 arányban hígítjuk, 30 percig 56...58 X-en inaktiváljuk. Mindegyik szérumot két sor 0,5 ml-es csőbe öntjük. A komplementet minden sor kémcsövébe növekvő mennyiségben adjuk, mint a hemolitikus rendszerben történő titráláskor; kezdjük a hemolitikus rendszerben a titerhez vett mennyiséggel, majd minden további kémcsőben 0,03 ml-rel növeljük az adagot, fiziológiás oldattal 0,5 ml-re állítva a térfogatot.

Ezt követően 0,5 ml antigént adunk a pozitív és normál szérummal rendelkező kémcsövek egy sorába, és minden szérum második sorába 0,5 ml fiziológiás oldatot adunk. Minden kémcsövet felrázunk, és 30...40 percre vízfürdőbe helyezzük. Ezután minden kémcsőbe 0,5 ml hemolizint és 0,5 ml eritrocitát adunk, összerázzuk és ismét vízfürdőbe helyezzük 10...15 percre. A legkisebb mennyiségű komplement, amely biztosította a vörösvértestek teljes lízisét a két normál szérum kémcső mindkét sorában (antigénnel és antigén nélkül), minden pozitív szérum egy sorában (antigén nélkül) és teljes késéssel (hiányával) hemolízis pozitív szérumok soraiban antigénnel (ugyanabban a komplement dózisban), ún komplement titer, amelyet az RSC diagnosztikai vizsgálatok fő tapasztalatának felállításához használnak fel.

Az RSC (maga a diagnosztikai kutatás) fő tapasztalata. A vizsgált szérumminták számának megfelelően két sor kémcsövet helyeznek el az állványokba. Mindegyik inaktivált szérumból 0,5 ml-t öntünk két kémcsőbe: az egyikbe antigént adunk - 0,5 ml, a másikba (antigén nélkül) 0,5 ml sóoldatot, és komplement hozzáadásával bakteriolitikus rendszert készítünk, majd hemolitikust. tette hozzá.

Szükséges komponensek: 1) tesztszérum, inaktivált, fiziológiás oldattal 1:10 arányban hígítva; 2) specifikus antigén, a biogyár által a csomagolás címkéjén feltüntetett titer szerint hígítva; 3) komplement a megállapított titerben; 4) hemolizin a munkatiterben; 5) mosott birka eritrociták 1:40 arányú szuszpenziója; 6) fiziológiás NaCl-oldat. A tesztszérumokat két sor csőbe öntjük. Tetszőleges számú vizsgálati szérum esetén egy ismert pozitív szérumot (ami pozitív eredményt ad) és egy normált (egészséges állatból származó, negatív eredményt adó) használunk kontrollként.

A bakteriolitikus rendszer összetevőit tartalmazó csöveket összerázzuk és 20...40 percre 37...38°C-os vízfürdőbe helyezzük. A második sor antigén nélküli bakteriolitikus rendszer kémcsövéit összerázzuk és vízfürdőbe helyezzük azonos körülmények között.

Ezután a hemolitikus rendszer komponenseit hozzáadjuk az első és második sor összes kémcsőéhez, és másodszor is vízfürdőbe helyezzük 10...15 percre. A második sor összes antigén nélküli csövében teljes hemolízis megy végbe.

A végeredmény megszerzése előtt a kémcsöveket szobahőmérsékleten hagyják 18...24 órán keresztül. Minden antigén nélküli kémcsőben, függetlenül attól, hogy a szérumot beteg vagy egészséges állatból nyerték, először hemolízisnek kell bekövetkeznie sor kémcsövek antigénnel, tisztább eredményt fejez ki állásban .

A tesztszérumot tartalmazó kémcsövekben a reakcióleolvasások megbízhatónak tekinthetők, ha nincs hemolízis a pozitív szérumot és antigént tartalmazó kémcsövekben, teljes hemolízissel az antigén nélküli pozitív szérumot tartalmazó kémcsövekben és minden nyilvánvalóan normális szérumot tartalmazó kémcsőben (61. ábra). ).

Ezt a reakciót az antigén, a komplement, a hemolizin és az eritrociták kontrolljának kell kísérnie. Ehhez birka vörösvértestekkel rendelkező antigént külön kémcsövekbe öntünk; kiegészíti hemolizin nélküli vörösvértestekkel; hemolizin vörösvértestekkel komplement nélkül; vörösvértestek és sóoldat. Az egyes kémcsövek térfogatát sóoldattal 2,5 ml-re kell beállítani. A kémcsöveket összerázzuk, és 20 percre 37 °C-os vízfürdőbe helyezzük. Nem lehet hemolízis minden kontroll csőben.

RSK eredménye Ezt szokás „keresztekkel” kifejezni. A pozitív reakció eredményének jelzői: + + + + (///) - a vörösvértestek teljes ülepedése (nincs hemolízis), az üledék feletti folyadék színtelen, + + + (///) - az üledék feletti folyadék alig észrevehetően sárgás. A reakció megkérdőjelezhető eredménye: az alján megtelepedett eritrociták jelenléte és a felülúszó részleges festődése a vörösvértestek egy részének lízise miatt + + - (++), azaz kettő és két és fél keresztezés. . Súlyos hemolízis (üledék nélkül) vagy kis üledékkel (+) negatív eredmény.

Hosszú távú komplementkötési reakció (LDCR). Hatékonyabb az érzékenységben, ellentétben a szokásos klasszikus RSK-val. A reakció lényege, hogy a bakteriolitikus rendszert három különböző hőmérsékleti viszonyok között tartjuk fenn: a komponensek keverése után szobahőmérsékleten 15 percig, majd alacsony hőmérsékleten (4 °C) hűtőszekrényben 18...20 órán át, és vízfürdő 15 percig. Ezt követően hozzáadjuk a hemolitikus rendszert, összerázzuk, ismét vízfürdőbe helyezzük, és feljegyezzük a reakciót, mint az RSC esetében. Az RDSC hatékonyságát számos fertőző betegség (tuberkulózis, vibriózis, brucellózis stb.) diagnosztizálásában igazolták.

Komplement rögzítési szuppressziós reakció (CPF), vagy gátlási reakció, indirekt FCC. Egy másik komponens is részt vesz ebben a reakcióban - standard immunszérum, amely a diagnózishoz általában használt antigén elleni antitesteket tartalmazza, és ezért pozitívan reagál a klasszikus CSC-ben.

A tesztszérumot összekeverjük az antigénnel, és egy ideig komplement nélkül hagyjuk. Ezután komplementet és standard szérumot adunk hozzá, a csöveket összerázzuk és 20...30 percre vízfürdőbe helyezzük, majd hozzáadjuk a hemolitikus rendszert és ismét vízfürdőbe helyezzük. Ha nincs hemolízis, az eredmény negatív, mert a tesztszérum nem reagált az antigénnel, az utóbbi pedig a standard szérummal, komplementet rögzítve. Ha a tesztszérum beteg állatból származik, akkor az antigénhez viszonyítva specifikus antitesteket tartalmaz, azaz az antigén és az antitestek között reakció megy végbe anélkül, hogy komplementet rögzítene. A tesztszérum antitesteivel kölcsönhatásba lépő antigén nem reagál (elnyomja) a standard (ismert specifikus) szérummal, a komplement szabad marad és reagál a hemolitikus rendszerben - hemolízis történik, a reakció eredménye pozitív. a tesztszérumhoz.

Módszer fluoreszcens antitestek (MFA). Ennek a módszernek a lehetőségei a szerológiai reakciók első fázisának specifikusságából adódnak a lumineszcens elemzés nagy érzékenységével. Az MFA végrehajtásához nagyon specifikus immunlumineszcens szérumra van szükség. Ismeretes, hogy a mikrobiológiai gyakorlatban alkalmazott különféle szerológiai reakciókban főként három komponens vesz részt: bakteriális antigén, antitest és komplement. Valójában mindhárom komponens antigén, és mindegyik ellen immunszérumot és ennek megfelelően lumineszcens antitesteket lehet nyerni. Attól függően, hogy milyen típusú fluoreszcens szérumot használunk (bakteriális antigén, antibakteriális antitestek, komplement ellen), a fluoreszcens antitest módszernek három fő változata van: direkt (1) és indirekt (2) variáns, valamint az indirekt variáns módosítása komplement segítségével. Az antigén és az antitest közötti immunológiai reakció ezekben a módosításokban közvetlenül a tárgylemezen megy végbe. A mikroorganizmusok rögzítésére szerves oldószereket használnak: acetont, etanolt, metanolt, dioxánt, valamint a mikrobiológiai gyakorlatban használt hagyományos fixálószereket: formalint, Nikiforov keveréket, Carnoy folyadékot stb.

Közvetlen lehetőség. A kész készítményre meghatározott ideig speciális lumineszcens szérumot viszünk fel, majd a felesleges szérumot lecsepegtetjük, a készítményt lemossuk és lumineszcens mikroszkóp alatt megnézzük. Ezt a módszert alkalmazzák a baktériumok kimutatására patológiás anyagokban, környezeti tárgyakban, valamint a kórokozók azonosítására a tenyészetekben.

Közvetett (kétlépcsős) lehetőség. Az első szakaszban az antigén specifikus kombinációja a megfelelő, jelöletlen szérum antitestével történik. A második szakaszban egy specifikus jelöletlen antitest kötődik egy fajellenes lumineszcens antitesthez, amely egy olyan állat szérumában található, amelyet az immunszérumot használó faj globulinjaival (vagy teljes vérszérumával) immunizáltak.

Közvetett anti-komplementer (háromlépcsős) lehetőség. Első szakasz: antigén-jelöletlen antitest komplex kialakulása. Második szakasz: komplementet tartalmazó normál szérum rétegezése. A harmadik szakasz: az antigén-antitest-komplement komplexet lumineszcens anti-komplementer szérummal kezeljük, amelyet nyulaknak a komplement forrásául szolgáló állatfaj szérumával történő immunizálásával állítunk elő.

Az MFA indirekt változatai mind antigének kimutatására, mind antitestek kimutatására használhatók. Ezenkívül a kétlépcsős opció beállításához korlátozott számú fajellenes lumineszcens szérumra van szükség (szarvasmarha, kos, ló, sertés stb. globulinok ellen), az anti-komplementer opcióhoz pedig elég ahhoz, hogy csak egy lumineszcens szérum legyen a tengerimalac globulinok ellen.

Az immunlumineszcencia és mikroszkópos módszerek. Az állatorvosi bakteriológiai laboratóriumok gyakorlatában biogyártott lumineszcens szérumokat használnak. A fluorokróm típusától függően a lumineszcens szérumok vagy zöld fényt (fluoreszcens alapú festék), vagy vörös fényt (rodamin alapú festék) biztosítanak.

Az immunlumineszcens mikroszkópos vizsgálathoz a vizsgálandó anyagot zsírmentes, vékony, karcmentes tárgylemezre kell felvinni. Az állati szervek és szövetek vizsgálatakor az ujjlenyomat-készítményeket vékony rétegben készítik el. A készítményeket levegőn szárítjuk és fixáló folyadékba helyezzük (etanol - 15 perc, metanol - 5 perc, aceton - 5 perc). Ha szükséges, rögzítés után a készítmények egy ideig hűtőszekrényben tárolhatók. A sorrend és a további eljárások az alkalmazott MFA-verziótól függenek (egylépcsős, kétlépcsős, háromlépcsős). A lumineszcens szérummal, valamint a jelöletlen első fázisú szérummal és komplementtel végzett preparátumok kezelését 37 °C-on nedves kamrában (Petri-csészék nedves szűrőpapírral) végezzük.

Egylépcsős lehetőség. A lumineszcens szérumot fix vizsgálati anyaggal (az ampullán feltüntetett hígításban) vigyük fel egy tárgylemezre. A gyógyszert 15...20 percre 37 °C-os nedves kamrába helyezzük, majd edényben pufferolt sóoldattal (pH 7,4) mossuk, az oldatot 5...10 perc elteltével többször cseréljük. vagy folyó csapvíz alatt 3...5 percig A víz legyen semleges és vasmentes. Ezután a készítményt (egy poháron több kenet is lehet) levegőn vagy szűrőpapírral megszárítjuk, majd egy cseppet. 8,0 pH-jú pufferolt glicerint alkalmazunk, és fedőüveggel fedjük le. Nem fluoreszcens merítőfolyadékot viszünk fel egy fedőlemezre, és mikroszkóp alatt vizsgáljuk meg.

Kétlépcsős lehetőség. Egy csepp első fázisú, jelöletlen immunszérumot a vizsgált anyaggal együtt egy tárgylemezre viszünk. A gyógyszert termosztátba helyezzük nedves kamrában 15...20 percre. Ezután a fent leírtak szerint mossuk, szárítjuk és egy csepp lumineszcens fajellenes szérumot alkalmazunk. A gyógyszert ismét termosztátba helyezzük nedves kamrában 15...20 percre. Ismételje meg a mosási eljárást, és szárítsa meg szűrőpapírral. Pufferolt glicerint alkalmazunk, fedőlemezzel lefedjük, nem fluoreszcens immerziós folyadékot alkalmazunk és mikroszkóposan megvizsgáljuk.

Háromlépcsős lehetőség (anti-komplementer). Egy csepp első fázisú, jelöletlen immunszérumot a vizsgált anyaggal együtt egy tárgylemezre viszünk. A gyógyszert a fent leírt módon termosztátba helyezzük, megszárítjuk, és egy csepp komplementet csepegtetünk a kenetre. A gyógyszert ismét nedves kamrába és termosztátba helyezzük 15...20 percre, majd lemossuk és lumineszcens anti-komplementer szérumot alkalmazunk. A további eljárások hasonlóak az egylépéses opcióhoz.

Ellenőrző készítmények készítése, feldolgozása. 1. Közvetlen lehetőségként az antigén és a lumineszcens szérum közötti reakció specificitásának meghatározásához heterológ mikrobafajtákból származó kenetkészítményeket kell kezelni ugyanazzal a szérummal. Ezeknek a fajoknak antigénikusan hasonlóaknak kell lenniük, de morfológiájukban különböznek a vizsgált mikroorganizmusoktól; antigénesen távol állnak a vizsgált mikroorganizmusoktól, de morfológiájukban és eloszlásukban hasonlóak azokhoz. A lenyomatkészítményeket lumineszcens normál szérummal kezeljük.

2. Az indirekt lehetőséghez három kontroll készítményt kell kezelni normál szérummal, lumineszcens anti-fajszérummal immunjelöletlen szérum nélkül és lumineszcens anti-fajszérummal ismert immunszérummal az első stádiumban.

3. A közvetett opcióhoz kiegészítéssel kontrollkészítmények szükségesek, amelyek kezelése során az immunszérumot azonos típusú és azonos hígítású normál szérum helyettesíti, valamint az immunszérum kivételével minden összetevővel kezelt készítmények.

Az eredmények értékelése. Figyelembe veszik a ragyogás fényerejét, színét, lokalizációját és szerkezetét. A fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt lumineszcens szérummal megfestett baktériumok a periféria mentén élénkzöld fényt mutatnak perem vagy halo formájában, a központi rész gyengén világít. Ezt a fényt specifikusnak nevezik, ellentétben a nem specifikusval, amikor az egész sejttest egyenletesen világít. Minél szembetűnőbb a baktériumsejt a készítményben, annál élesebb a pereme. Ez a ragyogás azzal magyarázható, hogy a sejt „perifériájának” egységnyi területéről többszörösen több antitest vetül a megfigyelő szemének retinájára, mint a mikrobasejt központi részéből. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a műanyag sejteknek (leptospirák, vibriók) nincs kontúrja, vagy az halványan észrevehető. A szövetfolyadékba merült sejtekben és a fiatal lépfene bacilusokban a körvonal általában elmosódott.

A lumineszcencia intenzitását a négykeresztes rendszer segítségével értékeljük: + + + + - nagyon fényes fluoreszcencia a mikrobasejt perifériáján, egyértelműen kontrasztban a sejt sötét testével; + + + - a sejtperiféria fényes fluoreszcenciája; + + - a sejt perifériájának gyenge fénye; + - nincs kontrasztos izzás a mikrobiális sejttest perifériáján. A meghatározott fény hiányát „-” jelzi (a mikroorganizmusok árnyékai láthatók). Különböző kórokozók diagnosztizálása során leggyakrabban a bakteriális sejtek legalább négy-három keresztezésének sajátos ragyogását tekintik pozitív eredménynek.

A komplementkötési reakciót (FFR) két fázisban hajtják végre: az első fázisban az antigént kombinálják a tesztszérummal, amelyben feltételezik az antitestek jelenlétét, komplementet adnak hozzá, és termosztátban 30 percig inkubálják.

Második fázis: hemolitikus rendszer hozzáadása (birka vörösvérsejtjei + hemolitikus szérum). A termosztátban 30 percig tartó inkubálás után az eredményt figyelembe veszik.

Pozitív RSC esetén a szérum antitestek az antigénnel egyesülve immunkomplexet alkotnak, amely komplementet köt, és nem megy végbe hemolízis. Ha a reakció negatív (nincs antitest a tesztszérumban), a komplement szabad marad, és hemolízis megy végbe.

Az RSC-t szifilisz, gonorrhoea, tífusz és más betegségek szerológiai diagnosztizálására használják.

A jelölt antigéneket és antitesteket alkalmazó immunreakciók azon alapulnak, hogy a reakcióban részt vevő egyik összetevőt (antigéneket vagy antitesteket) valamilyen könnyen kimutatható jelöléssel kombinálják. Jelölőként fluorokrómokat (RIF), enzimeket (ELISA), radioizotópokat (RIA) és elektronsűrűségű vegyületeket (IEM) használnak.

Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatot (ELISA), más immuntesztekhez hasonlóan, a következőképpen alkalmazzák: 1) ismeretlen antigén kimutatására ismert antitestek használatával vagy 2) antitestek kimutatására a vérszérumban ismert antigén használatával. A reakció sajátossága, hogy egy ismert reakciókomponenst egy enzimmel (például peroxidázzal) kombinálnak. Az enzim jelenlétét szubsztrát segítségével határozzák meg, amely az enzim működése során elszíneződik. A legszélesebb körben használt szilárd fázisú ELISA.

1) Antigén kimutatás. Az első lépés a specifikus antitestek adszorpciója a szilárd fázison, amelyet a műanyag panelek üregeinek polisztirol vagy polivinil-klorid felületeként használnak. A második szakasz a vizsgálati anyag hozzáadása, amelyben feltételezik az antigén jelenlétét. Az antigén antitestekhez kötődik. Ezt követően a kutakat kimossák. A harmadik szakasz egy adott antigén elleni antitesteket tartalmazó, enzimmel jelölt specifikus szérum hozzáadása. A jelölt antitesteket az antigénekhez kötik, és a felesleget mosással távolítják el. Így ha a vizsgált anyag antigéneket tartalmaz, akkor a szilárd fázis felületén enzimmel jelölt antitest-antigén-antitest komplex képződik. Az enzim kimutatásához szubsztrátot adunk hozzá. A peroxidáz esetében a szubsztrát pufferoldatban H 2 O 2 -vel kevert ortofenilén-diamin. Az enzim hatására barna színű termékek képződnek.

2) Antitestek kimutatása. Az első szakasz a specifikus antigének adszorpciója a lyukak falán. A kereskedelmi tesztrendszerekben jellemzően az antigének már a lyukak felületén adszorbeálódnak. A második szakasz a tesztszérum hozzáadása. Antitestek jelenlétében antigén-antitest komplex képződik. A harmadik szakasz - mosás után enzimmel jelölt antiglobulin antitesteket (humán globulinok elleni antitesteket) adnak a lyukakba. A reakció eredményeit a fent leírtak szerint értékeljük.

Nyilvánvalóan pozitív és nyilvánvalóan negatív mintákat használnak, amelyek kereskedelmi rendszerekben kaphatók, kontrollként.

Az ELISA-t számos fertőző betegség, különösen a HIV-fertőzés és a vírusos hepatitis diagnosztizálására használják.

Az immunoblot az ELISA egyik típusa (az elektroforézis és az ELISA kombinációja). A biopolimereket, például a humán immundeficiencia vírus antigénjeit gélelektroforézissel választják el. Ezután az elválasztott molekulák ugyanabban a sorrendben kerülnek a nitrocellulóz felületére, mint a gélben. Az átviteli folyamatot blottolásnak nevezik, a kapott nyomat pedig blot. Ezt a lenyomatot befolyásolja a vizsgált szérum. Ezután peroxidázzal jelölt anti-humán globulin szérumot adnak hozzá, majd a szubsztrátot, amely az enzim hatására barna színűvé válik. Barna csíkok képződnek azokon a helyeken, ahol az antitestek antigénekkel kombinálódnak. A módszer lehetővé teszi az egyes vírusantigének elleni antitestek kimutatását.

Radioimmunoassay (RIA). A módszer lehetővé teszi az antigén mennyiségének meghatározását a vizsgált mintában. Először egy feltételezhetően antigént tartalmazó anyagot adunk az immunszérumhoz, majd egy ismert, radioizotóppal jelölt antigént, például I 125-öt adunk hozzá. Ennek eredményeként a kimutatható (jelöletlen) és az ismert jelölt antigén korlátozott mennyiségű antitesthez kötődik. Mivel a jelölt antigént egy bizonyos dózisban adják hozzá, így meghatározható, hogy melyik része kötődik antitestekhez, és melyik része maradt szabadon a jelöletlen antigénnel való versengés miatt, és eltávolították. Az antitestekhez kötődő jelölt antigén mennyiségét számláló segítségével határozzuk meg. Ez fordítottan arányos a kimutatott antigén mennyiségével.

Immunelektronmikroszkópia (IEM). Egy antigén, például egy influenzavírus, egy elektronsűrű anyaggal jelölt specifikus antiszérumhoz kapcsolódik. Fémtartalmú fehérjéket (ferritin, hemocianin) vagy kolloid aranyat használnak jelölésként. A mikroszkópos vizsgálat során egy elektronmikroszkópban fényképeket készítenek, amelyeken az influenza virionok láthatók, amelyekhez sötét pontok kapcsolódnak - jelölt antitestek molekulái.

Ellenőrző kérdések

Szerzett immunitás, különbsége az örökletestől (specifikus, veleszületett). A szerzett immunitás típusai.

Feladat. A család hároméves gyermeke, Valerij diftériában megbetegedett. A család többi tagja nem betegedett meg, az anya gyermekkorában diftériás volt, az apa pedig diftéria toxoiddal volt beoltva. Az ötéves nővér, Natasha orvosi ellenjavallatok miatt egy időben nem kapott diftéria toxoid oltást, ezért sürgősségi profilaxist kellett végeznie diftéria elleni antitoxikus szérum segítségével. Az öccse, a három hónapos Vitalij nem lett beteg, bár nem oltották be semmivel. Egy macska és egy kutya van a házban, nem betegek. Minden családtagnál és állatoknál nevezze meg azt az immunitás típusát, amely megakadályozta, hogy megbetegedjenek.

Mi az antigén? Milyen anyagok lehetnek antigének? Teljes értékű antigének és haptének, miben különböznek egymástól? Az antigén szerkezete. Mi a neve az antigénmolekula azon részének, amely meghatározza a specificitását? Nevezze meg azokat az antigéneket, amelyeket ismer. Mik azok az autoantigének? A mikrobiális sejt antigén szerkezete. Flagelláris és szomatikus antigének; lokalizáció, betűjelölés, kémiai jelleg, kapcsolat a hőmérséklettel, elkészítési mód, gyakorlati alkalmazás. Anatoxin, tulajdonságai, alkalmazása, előállítása. Milyen szövet alkotja a szervezet immunrendszerét? Jelölje meg az emberi immunrendszer központi és perifériás szerveit. Ismertesse a humorális és celluláris immunválasz kialakulásának folyamatát! Határozza meg azokat a sejteket, amelyek elfogják és megemésztik az antigént; sejtek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a humorális immunitás, a celluláris immunitás kialakulásában; sejtek, amelyek átalakulnak és antitesteket termelő plazmasejtekké válnak; sejtek, amelyek stimulálják ezt a folyamatot; sejtek, amelyek elnyomják az immunválaszt; olyan sejtek, amelyek elpusztítják a tumorsejteket és a vírussal fertőzött sejteket. Mik azok az antitestek? Hogyan lehet immunszérumot szerezni? Hogyan lehet olyan szérumot szerezni, amely semlegesíti a tetanusztoxint? Milyen antigének ellen képződnek antitoxinok, agglutininek és hemolizinek? Milyen antitestek keletkeznek, amikor diftéria toxoidot juttatnak a szervezetbe? diftéria baktérium? Az antitestek kémiai természete és szerkezete. Mi az immunglobulin aktív helye? Sorolja fel az immunglobulinok osztályait és tulajdonságaikat! Jelölje meg azon immunglobulinok osztályát, amelyek áthatolhatnak a placentán. Melyik osztályba tartoznak a szekréciós immunglobulinok? Az antitest-felhalmozódás dinamikája. Miben különbözik a másodlagos immunválasz az elsődlegestől? Hogyan használják fel az immunválasz dinamikájára vonatkozó ismereteket a gyakorlati gyógyászatban? Mik az immunreakciók, mi a mechanizmusuk, a reakció fázisai. Milyen 2 irányban alkalmazzák az immunreakciókat? Sorolja fel az immunreakciókat!

Feladat. Cserélje ki a hiányzó szavakat „anatoxin” vagy „antitoxin” szavakkal: _________ egy antigén, _____________ egy antitest, __________ aktív immunitást hoz létre a szervezetbe juttatva, __________ passzív immunitást hoz létre a szervezetbe juttatva, __________ állatok immunizálásával nyerik, ___________ formalinnak és hőnek kitéve egy toxinból nyerik, _______________ semlegesíti a méreganyagokat, __________ antitestek képződését okozza a szervezetben.

Agglutinációs reakció: mi az agglutináció, mi az antigén, mi az antitest; beállítási módszerek, milyen vezérlők vannak beállítva és miért; hogy nézzenek ki a kezelőszervek. Agglutináló szérumok, mit tartalmaznak, hogyan nyerik, mire használják; Mi az agglutináló szérum titere? Közvetett (passzív) hemagglutinációs reakció: mi szolgál antigénként ebben a reakcióban, hogyan nyerhető, a reakció mechanizmusa. Mi az eritrocita diagnosztika? Mi az antitest vörösvértest diagnosztika? Kicsapódási reakciók: mi a csapadék, mi szolgál antigénként; Hogyan szerezzünk kicsapó szérumot? Mi a kicsapódó szérumtiter? Beállítási módszerek, gyakorlati alkalmazás.

Komplementrögzítési reakció (CFR): a CFR elve; mi képződik, amikor az immunszérum kölcsönhatásba lép egy specifikus antigénnel; mi történik a komplementtel, ha jelen van az interakció során? Mi a komplement sorsa, ha nincs specifikus affinitás az antigén és az antitestek között? Ha az RSC végeredménye hemolízis, ez pozitív vagy negatív eredményt jelent? Az RSC beállításának módszertana. Miért kell a tesztszérumot inaktiválni? Hemolitikus szérum: mit tartalmaz, hogyan nyerik, mi a titere és hogyan határozzák meg? Komplement: kémiai természet, kapcsolat a magas hőmérséklettel, hol található? Hogyan lehet tönkretenni a kiegészítést? Mit használnak a gyakorlatban kiegészítőként?

Feladat. Egy gyilkossággal vádolt férfi ruháján vérfoltot találtak. Milyen reakcióval lehet megállapítani, hogy emberi vérről van-e szó? mi lesz ebben a reakcióban antigén és mi lesz antitest; Milyen diagnosztikai gyógyszernek kell rendelkezésre állnia a laboratóriumban erre a reakcióra, hogyan kell elkészíteni?

Feladat. Hogyan használjuk a kicsapódási reakciót annak meghatározására, hogy az elemzésre szállított húsminta szarvasmarha- vagy lóhús-e; milyen diagnosztikai gyógyszerekre van szükség?

Kicsapási reakció agar gélben, formulázási módszerek, gyakorlati alkalmazás.