FISH teszt: a rák gyors diagnosztizálása. Halelemzés mellrákra Fluoreszcens in situ hibridizáció

Hagyományos citogenetika a kariotípus tanulmányozása során mindig a sávfelbontási szintre korlátozódott. Még a differenciális kromoszómafestés nagy felbontású módszereinek alkalmazásakor is csak több sávot észleltünk egy kromoszómán, de nem voltunk biztosak abban, hogy a felbontás molekuláris szintjére jutottunk. A DNS-technológia és a citogenetika közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette a FISH-módszerek alkalmazását a kromoszómális DNS-ben bekövetkező változások molekuláris szintű elemzésére. A molekuláris citogenetika forradalmi áttörést hozott a citogenetikában, lehetővé téve:

A kromoszómák DNS-szerkezetének elemzése 10-100 kilobázis tartományban;
nem osztódó interfázisú sejtek diagnosztizálása, ami óriási hatással volt a prenatális diagnózisra és a preimplantációs genetikai diagnózisra (PGD).

FISH technológia DNS-próbát használ, amely megköti vagy összekapcsolja a kromoszómán belüli specifikus DNS-szekvenciákat. A denaturált próbát a sejt natív DNS-ével inkubálják, amely szintén egyszálú állapotba denaturálódik. A szonda a biotin-dezoxiuridin-trifoszfátot vagy a digoxigenin-uridin-trifoszfátot timidinre cseréli. A natív DNS próbával történő renaturálása után a próba-DNS komplex fluorokrómmal jelölt biotinkötő avidin vagy fluorokrómmal jelölt anti-digoxigenin hozzáadásával detektálható. További jelerősítés érhető el antiavidin hozzáadásával és a kapott komplex fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával. Különböző DNS-próbák több különböző fluorokrómmal való megjelölésével lehetőség nyílik egy sejten belüli több kromoszóma vagy kromoszómaszegmens egyidejű megjelenítésére többszínű jelként.

Meghatározási lehetőség specifikus génszegmensek A kromoszómákon jelenlévő vagy hiányzó génszekvencia-szindrómák DNS-szintű diagnosztizálását, valamint az interfázisú magokban, gyakran az egyes sejtekben bekövetkező transzlokációkat tette lehetővé.

Anyag a HAL vagy az osztódó sejtekből nyert metafázisú kromoszómák, vagy az osztódás stádiumában nem lévő sejtekből származó interfázisos magok szolgálhatnak. A metszeteket RNázzal és proteinázzal előkezelik, hogy eltávolítsák az RNS-t, amely kereszthibridizálódhat a próbával és a kromatinnal. Ezután formamidban hevítik a DNS denaturálására, és jéghideg alkohollal rögzítik. A próbát ezután melegítéssel hibridizációra készítik elő. A próbát és a kromoszómapreparátumot ezután összekeverjük, és 37 °C-on fedőlemezzel lezárjuk a hibridizációhoz. Az inkubációs hőmérséklet vagy a hibridizációs oldat sóösszetételének változtatásával a kötődési specifitás növelhető és a háttérjelölés csökkenthető.

Fluoreszcencia in situ hibridizáció alkalmazása - FISH technológia

A FISH technológia hatékonysága először a gének lokalizálásával mutatták ki. A fluoreszcens jelölés bevezetésével az in situ hibridizáció nélkülözhetetlennek bizonyult a hagyományos sávozási módszerekkel nem észlelt kromoszóma-rendellenességek diagnosztizálásában. A FISH kulcsszerepet játszott a modern genetika egyik legkülönlegesebb felfedezésében: a genomi lenyomatozásban is.

Fejlesztési technológiája HAL három formában érkezett. A Centromer vagy alfa-szatellit próbákat relatív kromoszómaspecifitás jellemzi, és leggyakrabban az interfázisú sejtek genetikájában alkalmazták. Ezek a próbák kissé diffúz, megfelelő erősségű jeleket generálnak a centromer régióban, de nem kereszthibridizálódnak hasonló centromer szekvenciájú kromoszómákkal. Jelenleg olyan egykópiás szondákat fejlesztettek ki, amelyek egy adott kromoszómasávból diszkrét jelet adnak, és elkerülik a kereszthibridizáció jelenségét. Ezek a próbák arra is használhatók, hogy meghatározzák a kópiaszámot és azon kromoszómarégiókat, amelyekről feltételezhető, hogy egy adott szindrómához kapcsolódnak. A 13-as, 18-as, 21-es, X és Y kromoszómára tervezett egykópiás és centromer szondákat használják a prenatális diagnózishoz.

Lehetőség van a teljes kromoszómák „festésére” is HAL. A spektrális kariotipizálási technológiának köszönhetően, amely különböző fluorokrómok keverékét használja, ma már lehetőség nyílik egyedi fluoreszcens mintázat létrehozására minden egyes kromoszómához 24 különálló színnel. Ez a technológia lehetővé teszi olyan összetett kromoszóma-átrendeződések kimutatását, amelyek a hagyományos citogenetikai technikákkal nem láthatók.

Módszer HAL a prenatális diagnosztikában. Az előrehaladott reproduktív korú nők számára a terhesség nem annyira örömre, mint inkább aggodalomra adhat okot. A nő életkora a magzati kromoszóma-rendellenességek kialakulásának kockázatával jár. Az amniocentézis a terhesség 16. hetében történik, majd a kariotípus elemzés 10-14 napig tart. A FISH előzetes vizsgálatban történő alkalmazása felgyorsíthatja a diagnózist és csökkentheti a várakozási időt. A legtöbb genetikus és laboratórium azon a véleményen van, hogy a FISH-t nem szabad elszigetelten használni a terhesség további kezelésével kapcsolatos döntések meghozatalához. A FISH-módszert ki kell egészíteni kariotípus-analízissel, melynek eredményeinek legalább korrelálniuk kell az ultrahangos vagy biokémiai szűrés kóros képével az anya vérében.

Gén szindrómák sorozatok más néven mikrodeléciós szindrómák vagy szegmentális aneuszómia. Ezek a szomszédos kromoszómafragmensek deléciói, amelyek általában sok gént érintenek. A génszekvencia-szindrómákat először 1986-ban írták le klasszikus citogenetikai technikákkal. Most a FISH-nak köszönhetően lehetséges a szubmikroszkópos deléciók DNS-szinten történő azonosítása, ami lehetővé tette egy adott szindróma kialakulásához kapcsolódó legkisebb deletált régió, az úgynevezett kritikus régió azonosítását. A szindróma kritikus régiójának azonosítása után gyakran lehet azonosítani azokat a specifikus géneket, amelyek hiánya a szindrómához kapcsolódik. Egy nemrégiben megjelent génszekvencia-szindrómák kézikönyve 18 deléciós és mikrodeléciós szindrómáról számol be, amelyek 14 kromoszómához kapcsolódnak. A leggyakoribb génszekvencia-szindrómák és klinikai megnyilvánulásai a táblázatban találhatók. 5-2.

Telomerek- a kromoszómák hosszú és rövid karjainak végeit borító képződmények. Ismétlődő TTAGGG szekvenciákból állnak, és megakadályozzák a kromoszómák végeinek fúzióját egymással. A telomer próbák fontos szerepet játszanak a hagyományos citogenetikai módszerekkel nem kimutatható komplex transzlokációk felismerésében. Emellett a Human Genome Project egyik felfedezése az volt, hogy a kromoszómák telomerekkel szomszédos régiói gazdagok génekben. Mostanra kimutatták, hogy a szubmikroszkópos szubtelomer deléciók felelősek számos genetikailag meghatározott betegség előfordulásáért.

A HER-2 tumor státusz meghatározása FISH segítségével- a daganatok kialakulására való hajlam vizsgálata és az emlőrák (BC) vagy gyomorrák (GC) megfelelő időben történő kezelésének kiválasztása.

HER-2 (HER-2/neu)- a humán epidermális növekedési faktor receptor-2 egy olyan fehérje, amely befolyásolhatja a rákos sejtek növekedését. Egy speciális gén, a HER-2/neu gén hozza létre. A HER-2 egy bizonyos növekedési faktor, az úgynevezett humán epidermális növekedési faktor receptora, amely az emberben természetesen előfordul. Amikor az emberi epidermális növekedési faktor az emlőráksejtek HER-2 receptoraihoz kapcsolódik, serkentheti ezeket a sejteket növekedésre és osztódásra. Egészséges szövetekben a HER-2 olyan jeleket továbbít, amelyek szabályozzák a sejtproliferációt és a túlélést, de a HER-2 túlzott expressziója a sejtek rosszindulatú átalakulását okozhatja.

A HER-2 túlzott expressziója az emlőrák egyes altípusaiban fokozott proliferációhoz és angiogenezishez, az apoptózis diszregulációjához (genetikailag programozott sejtönpusztulás) vezet. Kimutatták, hogy emlőrákban ennek a receptornak a tumorszövetben történő túlzott expressziója a betegség agresszívabb lefolyásával, a daganat megnövekedett metasztatikus potenciáljával és kevésbé kedvező prognózissal jár. A HER-2 túlzott expressziója és az emlőrák kedvezőtlen prognózisa közötti összefüggés felfedezése olyan kezelési megközelítések kutatásához vezetett, amelyek célja a HER-2/neu onkogén specifikus blokkolása (célzott anti-HER2 terápia).

Mellrák (BC)- az emlőmirigy mirigyszövetének rosszindulatú daganata. Az emlőrák az első helyen áll a nők rosszindulatú betegségei között.

A daganat biológiai markereinek - a hormonális receptorok (ösztrogén és/vagy progeszteron) expressziója - jelenlététől függően megkülönböztetik a HER-2 - hormonreceptor-pozitív, HER-2-pozitív és tripla negatív emlőrák expresszióját.

A HER-2/neu-pozitív (HER-2+) típusú emlőrákot a HER-2/neu fehérje magas expressziója jellemzi.
A HER=2/neu-negatív (HER-2-) típusú emlőrákot a HER-2/neu fehérje alacsony expressziója vagy hiánya jellemzi.
Úgy gondolják, hogy minden ötödik emlőrákos nőnek HER-2-pozitív daganata van. A legtöbb emlőrák hormonfüggő: az ösztrogének és a progeszteron serkentő hatással vannak rájuk (proliferatív és daganatos). HER-2-pozitív emlőrákban a HER-2 receptorok feleslege van a daganatsejtek felszínén. Ezt a jelenséget „pozitív HER-2 státusznak” nevezik, és a mellrákban szenvedő nők 15-20%-ánál diagnosztizálják.

HER-2- a 2-es típusú humán epidermális növekedési faktor receptora, amely normálisan jelen van a szövetekben, részt vesz a sejtosztódás és -differenciálódás szabályozásában. Túlzott mennyisége a daganatsejtek felszínén (túlexpresszió) meghatározza a daganat gyors kontrollálatlan növekedését, a metasztázisok magas kockázatát és egyes kezelési módok alacsony hatékonyságát. A HER-2-pozitív emlőrák különösen agresszív formája ennek a betegségnek, ezért a HER-2 státusz pontos meghatározása kulcsfontosságú a kezelési taktika megválasztásában.

Gyomorrák (GC)- rosszindulatú daganat, amely a gyomornyálkahártya hámjából származik.

A GC a 4. helyen áll a rákos megbetegedések és a 2. helyen a rákos halálozás szerkezetében a világon. A gyomorrák előfordulása a férfiaknál 2-szer magasabb, mint a nőknél. Oroszország azon régiók egyike, ahol magas a gyomorrák előfordulási gyakorisága és a betegség miatti halálozás. A GC korai stádiumban történő diagnosztizálása nehéz a betegség hosszú tünetmentes lefolyása miatt. A GC-t gyakran késői stádiumban észlelik, amikor az 5 éves túlélési arány nem haladja meg az 5-10%-ot, és továbbra is a kemoterápia az egyetlen kezelési módszer.

A gyomorrák kezelésének fő módja a műtét. A legtöbb betegnél azonban a diagnózis felállításakor egy széles körben elterjedt daganatos folyamatot határoznak meg, ami lehetetlenné teszi a radikális műtétet és szisztémás gyógyszeres kezelést igényel. A kemoterápia statisztikailag szignifikánsan növeli az áttétes rákos betegek teljes túlélését, javítva ezzel életminőségüket.

A HER-2 (erbB-2) onkogént kezdetben emlődaganatokban azonosították. Ennek a génnek az amplifikációja és túlzott expressziója viszonylag specifikus esemény az emlőkarcinómák esetében, és gyakorlatilag nem fordul elő más lokalizációjú daganatokban. Úgy tűnik, hogy a gyomorrák a kevés kivételek egyike: a HER-2 aktiválódását e szerv rosszindulatú daganatainak körülbelül 10-15%-ában figyelik meg, és ez korrelál a betegség agresszív lefolyásával.

A HER-2 túlzott expressziója a rossz prognózis egyik tényezője. Különböző tanulmányok szerint a HER-2 gén amplifikációja rákos betegekben korrelál az alacsony általános túlélési aránnyal.

A HER-2 státusz felmérésére rák és emlőrák esetén a FISH módszert alkalmazzák.

HAL- a kutatás lehetővé teszi a kromoszómák minőségi és mennyiségi változásainak meghatározását rosszindulatú vérbetegségek és szolid daganatok diagnosztizálására.

Ma a FISH-vizsgálatokat világszerte széles körben alkalmazzák.

A FISH módszer (fluoreszcens in situ hibridizáció) a rákos sejtekben található HER-2/neu gének számának vizsgálata.

Javallatok:

• emlőrák - prognózis és a terápia kiválasztása céljából;
• gyomorrák - prognózis és a terápia kiválasztása céljából.

Szövettani protokoll és immunhisztokémiai protokoll, IHC üveg szükséges.

Az eredmények értelmezése
A FISH-teszt eredményeit a következőképpen fejezzük ki:

1. Pozitív (megnövekedett tartalom, a HER-2 gén amplifikációja van):

• HER-2 pozitív emlőrák;

• HER-2 negatív emlőrák.

Az onkológiai patológiák kezelésére a tudósok még nem dolgoztak ki tökéletes terápiás módszereket, amelyek elősegítik a gyógyulást. A mellrák halelemzése reményt ad a betegség korábbi diagnosztizálására. A módszer lehetővé teszi a nők számára, hogy a kezelést a legkorábbi stádiumban kezdjék meg, ami növeli a gyógyulás esélyeit.

Ami?

Az emlőrák halvizsgálata a korai diagnózis egyik progresszív és releváns eszköze. Angolról lefordítva az intracelluláris fluoreszcens hibridizáció tesztjét jelenti. Ezzel a génteszttel az onkológusok elemzik a daganatok eredetét. Az elemzés az agresszív típusú rák patogenezisében és progressziójában szerepet játszó gén – a HER2 – pozitív vagy negatív hatását is jelzi.

A tudományos kutatás folyamatos fejlesztése csökkenti a FISH-teszt költségeit, és egyre több nő számára teszi elérhetővé.

• megnagyobbodott nyirokcsomók a hónaljban;
• csomók a mellkas területén;
• fájdalom a mellbimbó megnyomásakor;
• az emlőmirigyek aszimmetriája;
• kellemetlen érzés és fájdalom az egyik mellben;
• mellbimbó váladékozása;
• ráncos bőr a mellen;
• fordított mellbimbó.

Elemzés elkészítése és leadása

A Phish teszt sikeres teljesítéséhez nincs szükség különösebb felkészülésre. Ne igyon alkoholt, csakúgy, mint bármilyen vizsgálat előtt, és egyen zsíros, húsos és nehéz ételeket. Az étel legyen könnyű, jobb, ha zöldségételek és gyümölcslevek. A mellrák haltesztje egy ártalmatlan és biztonságos eljárás, amely két szakaszban zajlik:

• Szövettani. Helyi érzéstelenítésben biopsziát végzünk az emlőből. A kapott anyagot speciális festékkel, fluoreszcens markerekkel dolgozzák fel. Kémiai tulajdonságaik alapján ezek a markerek kizárólag a sejtekben kijelölt kromoszómákhoz és azok készleteihez kötődnek. A vizsgálatok eredményeként a markerrel leginkább megfestett kromoszómakészletek láthatók, ami jelzi a genom változásának mértékét a rák szerint.
• Halelemzés. Egy DNS-komponenst, a dezoxiribonukleinsavat, amelyet specifikus markerekkel festenek meg, infundálnak a vénába. A marker címkék sejtszinten integrálódnak a genomokba. A vizsgálatot a beteg jelenlétében végzik, és az elemzés eredményeit azonnal közöljük.

Mit mutatnak az eredmények?

A mellrák halelemzése a következő eredményeket mutatja:

• Szövettani vizsgálat. Az eredmények a markerek telítettségén alapulnak a kromoszómakészletek területén. Az 1 vagy annál kevesebb szám azt jelenti, hogy nincs veszély. A szám egy határfeltételt jelöl, amely további elemzést igényel. A 3-as szám az onkológiai folyamat kialakulását jelzi.
• Halreakció emlőrákban. A negatív reakció eredménye azt jelenti, hogy a dezoxiribonukleinsav molekulák nem vesznek részt az atipikus sejtek patogenezisében. A rosszindulatú daganat kialakulása során a HER2 gén nem befolyásolja a rákos sejtet. Pozitív reakció esetén a rákmolekulák patogenezisében részt vevő gének osztódási sebessége megduplázódik.

Az Assuta Clinic kínálja. A fluoreszcens hibridizáció, más néven FISH, egy genetikai teszt, amely betekintést nyújt a daganat természetébe. Ha egy daganatot FIS segítségével tanulmányoz, az orvos tudni fogja, hogy a rák pozitív vagy negatív a HER2 génre nézve. A szervezet sejtjeiben jelenlévő gén másolatai serkentik az atipikus rákos sejtek növekedését. A diagnózis felállítása után az orvos részletesebb kezelési tervet készíthet.

Az Assuta klinika modern laboratóriumi komplexuma FISH elemzést végez az emlőrák patológiáinak értékelésére:

• Az egyedi vizsgálat pontos képet ad a daganat természetéről és jellemzőiről.
• Egy magánkórház hatalmas erőforrásokkal rendelkezik az eredmények eléréséhez.
• Izrael legjobb orvosait alkalmazzuk, a diagnosztikát és a terápiát egyedi séma szerint végezzük.

Hívjon, hogy megtudja, hogyan jelentkezhet a kezelésre. Állítsa helyre egészségét a Közel-Kelet legnagyobb kórházában.

Jelentkezzen be egy konzultációra

A mellrák haltesztje - az onkológia kialakulásának mechanizmusa

A HER2 génreceptorok felelősek a HER2 fehérjék termeléséért, amelyek a rákos sejteken jelen lévő receptorok. Amikor a receptorok aktiválódnak, a rákos sejtek osztódásra és szaporodásra utaló jelet kapnak. Normális esetben a HER 2 receptorok szabályozzák a mellsejtek növekedését, fenntartva a szövetek egészségének egyensúlyát.

Azonban bebizonyosodott, hogy minden ötödik rákos esetnél a HER 2 gén túltermelődik. Ez azt jelenti, hogy egy személy a gén egy példánya helyett mindegyik szülőtől származó génnel rendelkezik. Ez magyarázza a HER receptorok feleslegét a szervezetben, ami ellenőrizetlen és agresszív daganatnövekedést okoz.

Szükséges a mellrák haltesztje, hogy kiderüljön, milyen mértékben függ össze a szervezetben a patológia kialakulásának oka a receptorok kóros termelésével. Tudnia kell, hogy a rák típusa HER2 pozitív vagy negatív. Vannak kifejezetten a HER 2 pozitív emlőrák kezelésére kifejlesztett kezelések. Az elemzés lehetővé teszi, hogy ne vesztegessen időt a hatékony befolyásolási módszerek keresésére.

Amikor mellrák esetén halreakciót hajtanak végre, az orvos profilfestő anyagokat használ a kromoszóma-rendellenességek megjelenítésére. A vizsgált szövetre alkalmazott oldat anomáliák észlelését teszi lehetővé. A FIS analízis előnye, hogy olyan genetikai rendellenességeket is képes kimutatni, amelyek túl kicsik ahhoz, hogy alternatív módszerekkel mikroszkóp alatt vizsgálják őket.

A vizsgálat másik előnye, hogy a páciens néhány napon belül megkapja az eredményt, míg más módszerek csak néhány hét múlva adnak eredményt. A haltesztet az emlőmirigy rosszindulatú daganatának megállapítása mellett a hólyag daganatos patológiájának diagnosztikájában, a leukémia meghatározásában alkalmazzák.

Az elemzések típusai

A HER2 pozitív vagy negatív természetének megállapítására az Assuta klinika orvosai a pácienst saját laboratóriumukba utalják vizsgálatra. Kétféle teszt létezik:

• Immunhisztokémia – Az IHC nagy mennyiségű fehérjét észlel. A vizsgálat során a patológus mikroszkóp alatt megvizsgálja a szövetet speciális festőszerek segítségével. 1+ vagy 0 pont esetén nincs szükség további tesztelésre. A 2+ eredmény határozatlannak minősül, és további tesztelést igényel. A 3+ eredmény megerősíti a negatív forgatókönyvet.
• A MOG-teszt (hibridizáció) a következő lépés, ha rák gyanúja merül fel. Fontos, hogy az elemzést tapasztalt patológus végezze, amely kiküszöböli a hibákat a kapott eredmények értelmezésekor. A vizsgálatoknak két fő típusa van: a mellrákra irányuló halteszt és a fényes terepi vizsgálat. A pozitív halteszt a végleges diagnosztikai módszer.

Nagyon ritkán a halelemzés homályos vagy kétértelmű. Ilyen körülmények között a diagnózis megerősítéséhez újabb biopszia és új halteszt szükséges a mellrák kimutatására.

Hogyan történik a halteszt mellrák esetén - útmutató a páciens számára

A HER 2 státusz helyes diagnosztizálásához az orvos biopsziát végez, amely során a patológia által megváltoztatott szövetmintákat eltávolítják. A legtöbb esetben helyi érzéstelenítést alkalmaznak a kellemetlen érzések semlegesítésére. Ezt követően a kivont szövetet vizsgálatra küldik a laboratóriumba, ahol patológus dolgozik vele. Nagyon fontos, hogy a laboratórium mérvadó legyen az orvosi környezetben, mert a beteg élete közvetlenül függ a helyes diagnózistól. Bebizonyosodott, hogy az emlőrák haltesztje biztonságos eljárás. Nem igényel sok időt, külön eljárásokat a biopszián és a további szöveti traumán kívül.

Miért végeznek először IHC-tesztet? Egyszerűbb és elérhetőbb. Ha azonban a tesztek nem meggyőzőek, a FISH-teszt kötelező. Ritka esetekben ismételt biopszia és mintavétel lehetséges. De ez valójában rendkívül ritkán történik. Ha az emlőrák haltesztje pozitív HER2 eredményt mutat, akkor hatékony kezelést kap a HER2 pozitív rák kezelésére. Bár ez az állapot agresszív formája, az elmúlt években jelentősen javultak a vele diagnosztizált emberek kilátásai. Ez annak köszönhető, hogy Izraelben új és hatékony mellrák-kezeléseket alkalmaznak, amelyek a HER 2 receptorokat célozzák.

Jelentkezzen kezelésre

Rövid válasz: A fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) módszer magában foglalja egyedi DNS-nukleotid szekvenciák próbaként történő felhasználását a kívánt DNS-szekvenciák megkeresésére a pácienstől kapott anyagban. A módszer egy DNS-próba komplementer kötődésén alapul metafázisú kromoszómák vagy interfázisú sejtek DNS-éhez. A DNS-próba és a vizsgált DNS denaturálódik, és egyszálú DNS képződik. A DNS-próbát a kromoszómakészítményhez adjuk, és egy bizonyos ideig inkubáljuk. A hibridizáció után a fluorokrómmal jelölt próba jelenlétét vagy hiányát a DNS-ben a kromoszómák fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával határozzuk meg.

Részletes válasz: Fluoreszcens hibridizációs módszer in situ lehetővé teszi az egyes kromoszómák vagy azok egyedi metszeteinek azonosítását metafázisú kromoszómák vagy interfázisú magok preparátumain egy fluoreszcens jelöléssel konjugált DNS-próba és a kromoszómán lévő kívánt szakasz komplementer kölcsönhatása alapján. A peptid-nukleinsav vegyületek kromoszómán való megjelenítéséhez fehérjeterméken alapuló PNA-próbákat használnak.
A módszer egy DNS-próba komplementer kötődésén alapul metafázisú kromoszómák vagy interfázisú sejtek DNS-éhez, és a következő lépéseket tartalmazza:
1. Denaturáció kétszálú próba-DNS és cél-DNS egyszálú DNS-sé magas hőmérséklet vagy kémiai ágensek hatására.
2. Hibridizáció DNS-próba cél-DNS-sel a komplementaritás elve szerint, hogy kettős szálú hibrid molekulát alkosson
3. Hibridizáció utáni mosás a nem hibridizált DNS-próba eltávolítására
4. Elemzés hibridizációs jeleket fluoreszcens mikroszkóppal

Előnyök A FISH molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek magukban foglalják nagyszámú sejt gyors elemzését, nagy érzékenységet és specifitást, valamint a tenyésztetlen és nem osztódó sejtek tanulmányozásának képességét.
Hibák A módszer abban rejlik, hogy nem lehet információt szerezni a vizsgált DNS vagy kromoszóma szakasz fizikai állapotáról.
A FISH-t a prenatális molekuláris genetikai diagnosztikában és a daganatok jellemzésére használják; a gyermekgyógyászati ​​gyakorlatban általában a specifikus fejlődési rendellenességekhez kapcsolódó szubmikroszkópos deléciók azonosítására használják. A mikrodeléción alapuló szindrómákat korábban ismeretlen etiológiájú betegségeknek tekintették, mivel az ilyen betegségek kialakulását okozó kromoszóma-deléciókat és átrendeződéseket a hagyományos kromoszómaelemzési módszerek általában nem teszik lehetővé. Az ilyen kis deléciók a kromoszómák meghatározott régióiban nagy pontossággal detektálhatók FISH segítségével. A szubmikroszkópos deléciók által okozott betegségek közé tartozik Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith-Magenis szindrómák és velocardiofacialis szindróma. A FISH megkönnyíti ezen szindrómák diagnosztizálását atipikus esetekben, különösen csecsemőkorban, amikor a betegség számos diagnosztikailag jelentős tünete még hiányzik. A molekuláris genetikai diagnosztikai módszer alkalmazása serdülő- és felnőttkorban is célszerű, amikor a betegség gyermekkorra jellemző klinikai tünetei megváltoznak.

121. DNS-próbák. Használatuk örökletes betegségek meghatározásában.

Rövid áttekintés

A DNS-szonda az fluoreszceinnel, enzimmel vagy radioaktív izotóppal konjugált rövid DNS-fragmentum, amelyet a cél-DNS-molekula komplementer régiójával történő hibridizációra használnak.

Fő rész

DNS diagnosztikai rendszerek

Az élőlények tulajdonságainak sokféleségére vonatkozó információkat a genetikai anyag tartalmazza. Így a baktériumok patogenitását egy adott gén vagy génkészlet jelenléte határozza meg, és egy adott gén károsodása következtében örökletes genetikai betegség lép fel. Az ezt a biológiai tulajdonságot meghatározó DNS-szakasz szigorúan meghatározott nukleotidszekvenciával rendelkezik, és diagnosztikai markerként szolgálhat.

Számos gyors és megbízható diagnosztikai módszer alapja a nukleinsav-hibridizáció – különböző DNS-molekulák két komplementer szegmensének párosítása. Az eljárás általánosságban a következő.

1. Egyszálú DNS célpont rögzítése membránszűrőn.

2. Jelzett egyszálú DNS próba alkalmazása, amely bizonyos körülmények között (hőmérséklet és ionerősség) párosul a cél DNS-sel.

3. Mossa meg a szűrőt, hogy eltávolítsa a felesleges, nem kötött jelölt DNS-próbát.

4. Hibrid próba/célmolekulák kimutatása.

A nukleinsav-hibridizáción alapuló diagnosztikai tesztekben három komponens kulcsfontosságú: egy DNS-próba, egy cél-DNS és egy módszer a hibridizációs jel kimutatására. Az észlelőrendszernek nagyon specifikusnak és nagyon érzékenynek kell lennie.

*A fluoreszcein (dioxifluorán, uranin A) szerves vegyület, fluoreszcens festék. Az analitikai kémiában a fluoreszceint lumineszcens sav-bázis indikátorként használják. A biokémiában és a molekuláris biológiában a fluoreszcein-izotiocianát származékokat biológiai színezékként használják antigének és antitestek meghatározására.

* Az észlelés valaminek a felfedezése, azonosítása, megtalálása.

*konjugáció=ragozás

*Ha egy DNS-keveréket, például embert és egeret, egy „kémcsőben” megolvasztunk és összekeverünk, akkor az egér DNS-láncainak egyes szakaszai újra egyesülnek az emberi DNS-láncok komplementer szakaszaival, és hibridek jönnek létre. Az ilyen helyek száma a faj rokonsági fokától függ. Minél közelebb vannak egymáshoz a fajok, annál több DNS-szál komplementaritási területe van. Ezt a jelenséget az ún DNS-DNS hibridizáció.

122. A közvetlen DNS-diagnosztika alkalmazásának módszerei és feltételei.

Rövid ismertető:

Közvetlen módszerekkel kimutatják a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának szabálytalanságait (mutációkat és típusaikat). A direkt módszereket a közel 100%-os pontosság jellemzi.

A közvetlen diagnózis célja a mutáns allélek (a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának rendellenességei, mutációk és típusaik) azonosítása.

A direkt DNS-diagnosztikai módszer hátránya, hogy ismerni kell a gén pontos helyét és mutációi spektrumát. A közvetlen DNS-diagnosztikai módszerek olyan betegségek esetén javasoltak, mint a fenilketonuria (R408W mutáció), a cisztás fibrózis (a leggyakoribb delF508 mutáció), a Huntington-kór (a trinukleotid ismétlődések kiterjedése - CTG ismétlődések) stb.

Teljes válasz:

Közvetlen módszerekkel kimutatják a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának szabálytalanságait (mutációkat és típusaikat). A direkt módszereket a közel 100%-os pontosság jellemzi. A gyakorlatban azonban ezek a módszerek bizonyos feltételek mellett használhatók:

1) az örökletes betegség kialakulásáért felelős gén ismert citogenetikai lokalizációja,

2) a betegséggént klónozni kell, és ismerni kell a nukleotidszekvenciáját.

A közvetlen diagnózis célja a mutáns allélek (a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának rendellenességei, mutációk és típusaik) azonosítása. A közvetlen DNS-diagnosztikai módszer nagy pontossága a legtöbb esetben nem igényli az összes családtag DNS-elemzését, mivel a megfelelő gén mutációjának azonosítása lehetővé teszi a diagnózis közel 100% -os pontosságú megerősítését és az összes családtag genotípusának meghatározását. beteg gyermek, beleértve a heterozigóta hordozókat.

A direkt DNS-diagnosztikai módszer hátránya, hogy ismerni kell a gén pontos helyét és mutációi spektrumát.

A közvetlen DNS-diagnosztikai módszerek olyan betegségek esetén javasoltak, mint a fenilketonuria (R408W mutáció), a cisztás fibrózis (a leggyakoribb delF508 mutáció), a Huntington-kór (a trinukleotid ismétlődések kiterjedése - CTG ismétlődések) stb.

A mai napig azonban számos betegség génje nem került feltérképezésre, exon-intron szerveződésük ismeretlen, és számos örökletes betegségre jellemző a kifejezett genetikai heterogenitás, ami nem teszi lehetővé a direkt DNS-diagnosztikai módszerek teljes körű alkalmazását. Ezért a direkt DNS-diagnosztikai módszer információtartalma igen változatos. Így a Huntington-féle chorea, achondroplasia diagnosztizálása során ez 100%, fenilketonuria, cisztás fibrózis, adrenogenitális szindróma esetén 70-80%, Wilson-Konovalov-kór és Duchenne/Becker myopathia esetén pedig 45-60%. Ebben a tekintetben az örökletes betegségek molekuláris genetikai diagnózisának közvetett módszereit alkalmazzák.