Биологически активные вещества лекарственных растений. Химия биологически активных соединений Биологически активными веществами являются

Биологически активные вещества (БАВ) - химические вещества, необходимые для поддержания жизнедеятельности живых организмов, обладающие высокой физиологической активностью при небольших концентрациях по отношению к определенным группам живых организмов или их клеткам, злокачественным опухолям, избирательно задерживающие или ускоряющие их рост или полностью подавляющие их развитие .

В пище находится большинство из них, например: алкалоиды, гормоны и гормоноподобные соединения, витамины, микроэлементы, биогенные амины, нейромедиаторы. Все они обладают фармакологической активностью, а многие служат ближайшими предшественниками сильнодействующих веществ, относящихся к фармакологии .

БАВ-микронутриенты применяются для лечебно-профилактических целей в составе биологически активных пищевых добавок .

История изучения

Выделение биологически активных веществ в особую группу соединений обсуждалось на специальной сессии медико-биологического отделения Академии медицинских наук СССР в 1975 году .

В настоящий момент сложилось мнение, будто биологически активные вещества очень важны, но выполняют лишь частные, вспомогательные функции. Это ошибочное мнение обязано своим появлением тому, что в специальной и научно-популярной литературе функции каждого БАВ рассматривались в отдельности друг от друга. Этому содействовал и преимущественный акцент на специфических функциях микронутриентов. В результате появились «штампы» (например, что витамин С служит для профилактики цинги и только) .

Физиологическая роль

Биологически активные вещества имеют крайне разнообразные физиологические функции .

Литература

• Георгиевский В. П., Комиссаренко П. Ф., Дмитрук С. Е. Биологически активные вещества лекарственных растений . - Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1990. - 333 с. - ISBN 5-02-029240-0 .
• Попков Н. А., Егоров И. В., Фисинин В. И. Корма и биологически активные вещества : Монография. - Беларуская навука, 2005. - 882 с. - ISBN 985-08-0632-Х.
• С. Галактионов Биологически активные . - «Молодая гвардия», серия «Эврика», 1988.

Примечания

См. также

• Суточная потребность человека в биологически активных веществах

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Биологически активные вещества" в других словарях:

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА - все значимые для организмов соединения, способные регулировать реализацию адаптивного потенциала. Экологический энциклопедический словарь. Кишинев: Главная редакция Молдавской советской энциклопедии. И.И. Дедю. 1989 … Экологический словарь

Биологически активные вещества - (БАВ) общее название веществ, имеющих выраженную физиологическую активность... Источник: ВП П8 2322. Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года (утв. Правительством РФ 24.04.2012 N 1853п П8) … Официальная терминология

биологически активные вещества - сокр. БАВ Биологически активные вещества – вещества, которые могут действовать на биологические системы, регулируя их жизнедеятельность, что проявляется в эффектах стимулирования, угнетения, развития тех или иных признаков. Общая химия: учебник… … Химические термины

Биологически активные вещества – - общее название органи ческих соединений, участвующих в осуществлении к. либо функ ций организма, обладают высокой специфичностью действия: гор моны, ферменты и др.; БАВ … Словарь терминов по физиологии сельскохозяйственных животных

Лучистые грибки обладают очень ценным свойством способностью образовывать весьма разнообразные вещества, многие из которых имеют большое практическое значение. В естественных местах обитания между микроорганизмами складываются различные… … Биологическая энциклопедия

Вещества, полученные путем микробиологического и химического синтеза, вводимые в состав комбикормовой продукции с целью профилактики заболеваний, лечения, стимуляции роста и продуктивности животных. [ГОСТ Р 51848 2001] Тематики корма для животных … Справочник технического переводчика

биологически активные вещества (комбикормовой продукции) - 21 биологически активные вещества (комбикормовой продукции): Вещества, полученные путем микробиологического и химического синтеза, вводимые в состав комбикормовой продукции с целью профилактики заболеваний, лечения, стимуляции роста и… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

Биологически активные добавки (БАД) - биологически активные добавки природные (идентичные природным) биологически активные вещества, предназначенные для употребления одновременно с пищей или введения в состав пищевых продуктов;... Источник: Федеральный закон от 02.01.2000 N 29 ФЗ… … Официальная терминология

Биологически активные добавки - природные (идентичные природным) биологически активные вещества, предназначенные для употребления одновременно с пищей или введения в состав пищевых продуктов … Энциклопедический словарь-справочник руководителя предприятия

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ - в соответствии с Федеральным законом «О качестве и безопасности пищевых продуктов» природные (идентичные природным) биологически активные вещества, предназначенные для употребления одновременно с пищей или введения в состав пищевых продуктов … Юридическая энциклопедия

Книги

• Биологически активные вещества растительного происхождения. Том 2 , . Монография - наиболее полный справочник в области медицинской ботаники. Включены сведения о более чем 1500 биологически активных соединениях растительного происхождения с указанием их…
• Биологически активные вещества в физиологических и биохимических процессах в организме животного , М. И. Клопов, В. И. Максимов. В пособии изложены современные представления о строении, механизме действия, роли в процессах жизнедеятельности и функциях организма биологически активных веществ (витамины, ферменты,…

Биологически активные вещества

К биологически активным веществам относятся ферменты, гормоны, антибиотики, витамины.

Ферменты (энзимы) – специфические белки, выполняющие в организме функции биологических катализаторов. Известно около 1000 ферментов, катализирующих соответствующее число индивидуальных реакций. Ферменты имеют высокую специфичность действия, интенсивность, действуют в «мягких» условиях (температура 30-35ºС, нормальное давление, рН~7). Процесс катализа строго ограничен в пространстве и времени. Часто, вещества, образующиеся под действием одного фермента, являются субстратом для другого фермента. Ферменты имеют все уровни белковой структуры (первичная, вторичная, третичная; четвертичная – особенно для регуляторных ферментов). Структурная часть молекулы, принимающая непосредственное участие в катализе наз. Каталитическим участком. Контактная площадка – место на поверхности фермента, к которому прикрепляется вещество. Каталитический центр и контактная площадка образуют активный центр (в молекуле их обычно несколько). Группы ферментов:

1. Не имеющие небелковых компонентов;

2. Имеющие белковый компонент – апофермент и требующие для проявления активности определенные органические вещества – коферменты.

Иногда в состав фермента входят различные ионы, в том числе и ионы металлов. Ионный компонент называется ионным кофактором. Ингибиторы – вещества угнетающие активность ферментов, образуют с ними инертные соединения. Такими веществами иногда являются сами субстраты или продукты реакции (в зависимости от концентрации). Изоферменты – генетически детерминированные формы фермента в одном и том же организме, характеризующиеся сходной субстратной спецификой.

Классификация ферментов

Ферменты классифицируются по типу реакции, которую они катализируют. Классы:

1. Оксидоредутазы – катализируют реакции окисления.

2. Трансферазы – перенос функциональных групп.

3. Гидролазы – гидролитический распад.

4. Лиазы – негидролитическое отщепление определенных групп атомовс образованием двойной связи.

5. Изомеразы – пространственная перестройка в пределах одной молекулы.

6. Лигазы – реакции синтеза, сопряженные с распадом догатых энергией связей.

Гормоны – химические вещества, обладающие чрезвычайно высокой биологической активностью, образованы специфической тканью (железами внутренней секреции). Гормоны контролируют обмен веществ, клеточную активность, проницаемость клеточных мембран, обеспечивают гомеостаз, др. специфические функции. Обладают дистантным действием (разносятся кровью во все ткани). Образование гормонов контролируется по принципу обратной связи: не только регулятор влияет на процесс, но и состояние процесса влияет на интенсивность образования регулятора.

Классификация гормонов

Есть несколько классификаций гормонов: связанная с происхождением гормона, с его химическим составом и др. По химической природе гормоны делятся на (химическая классификация):

1. Стероидные – производные стеролов с укороченными боковыми цепями.

Эстрон, эстрадиол, эстриол – яичники; вызывают образование женских вторичных половых признаков.

Кетоны и оксикетоны:

Тестостерон (XVI) – семенники; вызывает образование мужских вторичных половых признаков.

Кортизон, кортизол, кортикостерон (XVII), 11-дегидрокортикостерон,17-оксикортикостерон – кора надпочечников; регулируют обмен углеводов и белков.

11-дезоксикортикостерон, альдостерон – кора надпочечников; регулируют обмен электролитов воды.

2. Пептидные.

Циклические октапептиды.

Окситоцин, вазопрессин – гормоны задней доли гипофиза.

Полипептиды.

Интермедин, хроматотропин – гормоны промежуточной доли гипофиза; вызывает расширение меланофор в хроматофорах кожи.

Адренокортикотропный гормон – гормон передней доли гипофиза; стимулирует функцию коры надпочечников.

Инсулин – гормон поджелудочной железы; регулирует обмен углеводов.

Секретин – гормон слизистых желез кишечника; стимулирует выделение панкреатического сока.

Глюкагон – гормон островков Лангеранса поджелудочной железы; повышает концентрацию сахара в крови.

Белковые вещества

Лютеотропин – передняя доля гипофиза; поддерживает функцию желтого тела и лактацию.

Паратиреокрин – околощитовидная железа; поддерживает концентацию кальция и фосфора в крови.

Соматотропин – передняя доля гипофиза; стимулирует рост, регулирует анаболизм белков.

Ваготонин – поджелудочная железа; стимулирует парасимпатическую нервную систему.

Центропнеин – поджелудочная железа; стимулирует дыхание.

Гликопротеины

Фолликулостимулирующий (гонадотропный) гормон – передняя доля гипофиза; стимулирует рост фолликул, яичников и сперматогенез.

Лютеинизирующий гормон – передняя доля гипофиза; стимулирует образование эстрогенов и андрогенов.

Тиреотропин – передняя доля гипофиза; стимулирует деятельность щтовиной железы.

3. Родственные тирозину.

Фенилалкиламины

Адреналин (XVIII), норадреналин (медиатор нервного возбуждения) – гормоны мозгового слоя надпочечников; повышают кровяное давление, вызывают гликогенолиз, гипергликемию.

Иодированые тиронины.

Тироксин, 3,5,3-трииодотиронин – гормоны щитовидной железы; стимулируют основной обмен.

Антибиотики – вещества, образованные микроорганизмами или получаемые из других источников, обладающие антибактериальным, антивирусным, противоопухолевым действием. Выделено и описано св. 400 антибиотиков, которые принадлежат к различным классам химических соединений. Среди них есть пептиды, полиеновые соединения, полициклические вещества.

Для них характерно избирательное действие на определенные виды микроорганизмов; характеризуются специфическим антимикробным спектром действия. Подавляют некоторые болезнетворные микроорганизмы, не повреждая при этом растительных и животных тканей. Антибиотики действуют встраиваясь в обмен веществ.

Классификация антибиотиков

Есть несколько классификаций антибиотиков. По происхождению:

1. Грибкового происхождения

2. Бактериального происхождения

3. Животного происхождения

По спектру действия:

1. С узким спектром действия – действующие на грамположительные микробы(различные кокки). Это: пенициллин, стрептомицин.

2. С широким спектром действия – действующие как на грамположительные так и на грамотрицательные микроорганизмы(различные палочки). Это: тетракциклины, неомицин.

(Грамположительные и грамотрицательные антибиотики отличаются по отношению к определенным красителям. Грамположительные образуют с крастелем окрашенный комплекс, который не обесцвечивается с спирте; грамотрицательные не окрашиваются).

3. Действующие на грибки – группа полиеновых антибиотиков. Это: нистатин, кандицидин

4. Действующие как на микроорганизмы так и на опухолевые клетки животных. Это: актиномицины, митомицин…

По типу противомикробной активности:

1. Бактерицидные.

2. Бактериостатические.

Витамины – группа дополнительных веществ еды, которые не синтезируются в организме человека. Витамины являются биологическими катализаторами химических реакций или реагентами фотохимических процессов в организме. Участвуют в обмене веществ в составе ферментных систем. В организмы человека и животных попадают из внешней среды. Некоторые производные витаминов с замещенными функциональными группировками оказывают противоположное по сравнению с витаминами действие, и называются антивитаминами. Становятся витаминами. Провитамины – вещества, которые после ряда превращений в организме

Классификация витаминов

Классификация по отношению к человеческому организму:

1. Повышающие общую активность организма – регулируют функциональное состояние центральной нервной системы (B1, B2, PP, A, C).

2. Антигеморрагические – обеспечивающие нормальную проницаемость и эластичность кровеносных сосудов (C, P, K).

3. Антианемические – регулируют кроветворение (B12, Bc, C).

4. Антиинфекционные – повышающие устойчивость организма к инфекциям (C, A).

5. Регулирующие зрение – усиливающие остроту зрения.(A, B2, C).

Также различают:

1. Водорастворимые (витамины С, В1, В2, В6, В12, РР, пантотеновая кислота, биотин, мезоинозит, холин, п-аминбензойная кислота, фолиевая кислота).

2. Жирорастворимые (витамины А, А2, D2, D3, Е, К1, К2).

Витамин А (ретинол) – влияет на зрение, рост (V).

Витамин В1 (тиамин) – участвует в обмене углеводов (VI).

Витамин В2 (рибофлавин) – участвует в обмене углеродов, жиров, белков; влияет на рост, зрение, центральную нервную систему (VII).

Витамин РР (никотиновая кислота) –участвует в клеточном дыхании (VIII).

Витамин В6 (пиридоксин)– участвует в усвоении белков, жиров; азотистый обмен (IX).

Витамин В9 (фолиевая кислота) – участвует в обмене веществ, синтезе нуклеиновых кислот, кроветворении (X).

Витамин В12 (цианокобаламин) – участвует в кроветворении (XI).

Витамин С (аскорбиновая кислота) – участвует в усвоении белков, восстановлении тканей (XII).

Витамин D (кальциферол) – участвует в обмене минеральных веществ (XIII).

Витамин Е (токоферол) – мышцы (XIV).

Витамин К (филлохиноны) – влияет на сворачиваемость крови (XV).

Неспецифические метаболиты .

Специфические метаболиты :

а). тканевые гормоны (парагормоны);

б). истинные гормоны.

Неспецифические метаболиты - продукты метаболизма, вырабатываемые любой клеткой в процессе жизнедеятельности и обладающие биологической активностью (СО 2 , молочная кислота).

Специфические метаболиты - продукты жизнедеятельности, вырабатываемые определенными специализированными видами клеток, обладающие биологической активностью и специфичностью действия:

а) тканевые гормоны - БАВ, вырабатывающиеся специализированными клетками, оказывают эффект в основном на месте выработки.

б) истинные гормоны - вырабатываются железами внутренней секреции

Участие БАВ на различных уровнях нейро-гуморальной регуляции:

I уровень : местная или локальная регуляция Обеспечивается гуморальными факторами: в основном - неспецифическими метаболитами ив меньшей степени - специфическими метаболитами (тканевыми гормонами).

II уровень регуляции : региональный (органный). тканевыми гормонами.

III уровень - межорганное, межсистемное регулирование. Гуморальная регуляция представлена железами внутренней секреции.

IV уровень. Уровень целостного организма. Нервная и гуморальная регуляция соподчинены на этом уровне поведенческой регуляции.

Регулирующее влияние на любом уровне определяется рядом факторов:

количество биологически активного вещества;

2. количество рецепторов;

3. чувствительность рецепторов.

В свою очередь чувствительность зависит:

а). от функционального состояния клетки;

б). от состояния микросреды (рН, концентрация ионов и т.д.);

в). от длительности воздействия возмущающего фактора.

Местная регуляция (1 уровень регуляции)

Средой является тканевая жидкость. Основные факторы:

Креаторные связи.

2. Неспецифические метаболиты .

Креаторные связи - обмен между клетками макромолекулами, несущими информацию о клеточных процессах, позволяющую клеткам ткани функционировать содружественно. Это один из наиболее эволюционно старых способов регуляции.

Кейлоны - вещества, обеспечивающие креаторные связи. Представлены простыми белками или гликопротеидами, влияющими на деление клеток и синтез ДНК. Нарушение креаторных связей может лежать в основе ряда заболеваний (опухолевый рост) а также процесса старения.

Неспецифические метаболиты - СО 2 , молочная кислота - действуют в месте образования на соседние группы клеток.

Региональная (органная) регуляция (2 уровень регуляции)

1. неспецифические метаболиты,

2. специфические метаболиты (тканевые гормоны).

Система тканевых гормонов

Накоплением знаний, анализом явлений и фактов занимается наука. Если в период своего зарождения наука была единой, неделимой и эта прекрасная, органически свойственная ей черта особенно ярко проявилась в энциклопедических трудах великих мыслителей древности, то позднее наступила пора дифференциации науки.

Из унитарной, стройной системы естествознания как единого целого возникли математика, физика, химия, биология и медицина , а в науках об обществе оформились история, философия, право ...

Это неизбежное дробление науки, отражающее объективные процессы в развитии мира, продолжается и сегодня - появились кибернетика, ядерная физика, химия полимеров, океанология, экология, онкология и десятки других наук.

Веянием времени стала и узкая специализация ученых , целых коллективов. Конечно, это отнюдь не исключает становления и воспитания широко образованных ученых с блестящей эрудицией, и мировая наука знает немало тому примеров.

И все же вопрос закономерен - не утрачивается ли в таком случае возможность осмысления целостной картины окружающего мира, не мельчает ли порой постановка проблем, не ограничиваются ли искусственно поиски путей их решения? Особенно для тех, кто только начинает свой путь к знаниям...

Отражением этого противоречия и прямым следствием действия законов диалектики явилось встречное движение наук по пути к взаимному обогащению, взаимодействию и интеграции .

Появились математическая лингвистика , химическая физика , биологическая химия ...

Что будет конкретным и конечным итогом этого непрерывного искания, постоянной смены целей и объектов исследования, предсказать пока трудно, но одно является очевидным - в конечном итоге человек достигнет прогресса и в тех областях знания, которые совсем недавно казались окутанными покровом глубокой тайны...

Одним из ярких примеров является та область науки, которая лежит на границе биологии и химии.

Что же объединяет эти научные дисциплины, в чем смысл их взаимодействия?

Ведь биология была и, пожалуй, еще долгое время будет одной из самых загадочных областей знания, и в ней остается немало белых пятен.

Химия же, напротив, относится к разряду наук наиболее устоявшихся, точных, в ней основные закономерности выяснены и проверены временем.

И тем не менее факт остается фактом - уже давно химия и биология идут навстречу друг другу.

Когда это началось, вряд ли можно сейчас установить... Попытки объяснения явлений жизнедеятельности с позиций точных наук мы находим еще у мыслителей древнегреческой и древнеримской цивилизации, более отчетливо подобные идеи формулировались в трудах выдающихся представителей научной мысли средневековья и эпохи Возрождения.

К концу XVIII в было достоверно установлено, что в основе проявления жизни лежа химические превращения веществ, порой простых, а зачастую удивительно сложных. И именно с этого периода начинается подлинная летопись о союзе двух наук, летопись, богатая ярчайшими фактами и эпохальными открытиями, фейерверк которых не прекращается и в наши дни...

На первых этапах в ней господствовали виталистические воззрения , утверждавшие, что химическиесоединения, выделяемые из живых организмов, не могут быть получены искусственным путем , без участия магической жизненнойсилы≫.

Сокрушительный удар сторонникам витализма был нанесенработами Ф. Вёлера, получившего типичное вещество животногопроисхождения - мочевину из цианата аммония . Последующимиисследованиями позиции витализма были окончательно подорваны.

В середине XIX в. органическая химия определяется уже как химия соединений углерода вообще - будь то вещества природного происхождения или синтетические полимеры, красители или лекарственные препараты.

Один за другим преодолевала органическая химия барьеры, стоящие на пути к познанию живой материи.

В 1842 г. Н. Н. Зинин осуществил синтез анилина, в 1854 г. М. Бертло получил синтезом ряд сложных органических веществ, в том числе жиры.

В 1861 г. А. М. Бутлеровым впервые было синтезировано сахаристое вещество - метиленитан, к концу столетия успешно осуществляются синтезы ряда аминокислот и жиров , а начало нашего века ознаменовалось первыми синтезами белковоподобных полипептидов .

Это направление, развивавшееся стремительно и плодотворно, оформилось к началу XX в. в самостоятельную химию природных соединений.

К числу ее блистательных побед можно отнести расшифровку строения и синтез биологически важных алкалоидов, терпеноидов, витаминов и стероидов, а вершинами ее достижений в середине нашего века надо считать полные химические синтезы хинина, стрихнина, резерпина, пенициллина и простагландинов.

Биологическими проблемами занимаются сегодня десятки наук, в которых тесно переплетаются идеи и методы биологии, химии, физики, математики и других областей знания.

Арсенал используемых биологией средств огромен. Именно в этом - один из источников ее бурного прогресса, основа достоверности ее выводов и суждений.

Пути биологии и химии в познании механизмов жизнедеятельности пролегают рядом, и это естественно, ибо живая клетка - настоящее царство больших и малых молекул, непрерывно взаимодействующих, возникающих и исчезающих...

Здесь находит сферу приложения и одна из новых наук - биоорганическая химия.

Биоорганическая химия - наука, которая изучает связь между строением органических веществ и их биологическими функциями.

Объектами изучения являются, такие как: биополимеры, витамины, гормоны, антибиотики, феромоны, сигнальные вещества, биологически активные вещества растительного происхождения, а также синтетические регуляторы биологических процессов (лекарственные препараты, пестициды и др.), биорегуляторы и отдельные метаболиты.

Являясь разделом (частью) органической химии эта наука также изучает соединения углерода.

В настоящее время насчитывается – 16 млн органических веществ.

Причины многообразия органических веществ:

1) Соединения атомов углерода (С) могут взаимодействовать друг с другом и другими элементами периодической системы Д. И. Менделеева. При этом образуются цепи и циклы.

2) Атом углерода может находиться в трех разных гибридных состояниях. Тетраэдрическая конфигурация атома С → плоскостная конфигурация атома С.

3) Гомология – это существование веществ с близкими свойствами, где каждый член гомологического ряда отличается от предыдущего на группу – СН 2 -.

4) Изомерия – это существование веществ, имеющих одинаковый качественный и количественный состав, но различное строение.

А) M. Бутлеров (1861 г.) создал теорию строения органических соединений, которая и по сей день служит научной основой органической химии.

Б) Основные положения теории строения органических соединений:

1) атомы в молекулах соединены друг с другом химическими связями в соответствии с их валентностью;

2) атомы в молекулах органических соединений соединяются между собой в определенной последовательности, что обусловливает химическое строение молекулы;

3) свойства органических соединений зависят не только от числа и природы входящих в их состав атомов, но и от химического строения молекул;

4) в молекулах существует взаимное влияние как связанных, так и непосредственно друг с другом не связанных атомов;

5) химическое строение вещества можно определить в результате изучения его химических превращений и, наоборот, по строению вещества можно охарактеризовать его свойства.

Итак, объектами изучения биоорганической химии являются:

1) биологически важные природные и синтетические соединения: белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды,

2) биополимеры смешанного типа - гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, гликолипиды и т. п.; алкалоиды, терпеноиды, витамины, антибиотики, гормоны, простагландины, ростовые вещества, феромоны, токсины,

3) а также синтетические лекарственные препараты, пестициды и др.

Биополимеры – высокомолекулярные природные соединения, которые являются основой всех организмов. Это белки, пептиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты (НК), липиды.

Биорегуляторы – соединения, которые химически регулируют обмен веществ. Это витамины, гормоны, антибиотики, алкалоиды, лекарственные препараты и др.

Знание строения и свойств биополимеров и биорегуляторов позволяет познать сущность биологических процессов. Так, установление строения белков и НК позволило развить представления о матричном биосинтезе белка и роли НК в сохранении и передаче генетической информации.

Основная задача биоорганической химии – выяснение взаимосвязи структуры и механизма действия соединений.

Итак, из сказанного понятно, что биоорганическая химия – это научное направление, сложившееся на стыке ряда отраслей химии и биологии.

В настоящее время она превратилась в фундаментальную науку. По существу она является химическим фундаментом современной биологии.

Разрабатывая основополагающие проблемы химии живого мира, биоорганическая химия способствует решению задач получения практически важных препаратов для медицины, сельского хозяйства, ряда отраслей промышленности.

Основные задачи:

- выделение в индивидуальном состоянии изучаемых соединений с помощью кристаллизации, перегонки,различных видов хроматографии, электрофореза, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования, противоточного распределения ит. п.;

- установление структуры, включая пространственное строение,на основе подходов органической и физико-органической химии сприменением масс-спектрометрии, различных видов оптическойспектроскопии (ИК, УФ, лазерной и др.), рентгеноструктурногоанализа, ядерного магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса, дисперсии оптического вращения и круговогодихроизма, методов быстрой кинетики и т. п. в сочетании с расчетами на ЭВМ;

- химический синтез и химическая модификация изучаемых соединений, включая полный синтез, синтез аналогови производных,- с целью подтверждения структуры, выяснения связи строения и биологической функции, получения практически ценных препаратов;

- биологическое тестирование полученных соединений in vitro и in vivo.

Решение основных проблем Б. х. важно для дальнейшего прогресса биологии. Без выяснения строения и свойств важнейших биополимеров и биорегуляторов нельзя познать сущность жизненных процессов, а тем более найти пути управления такими сложными явлениями, как:

Размножение и передача наследственных признаков,

Нормальный и злокачественный рост клеток,-

Иммунитет, память, передача нервного импульса и многое др.

В то же время изучение высокоспециализированных биологически активных веществ и процессов, протекающих с их участием, может открыть принципиально новые возможности для развития химии, химической технологии и техники.

К проблемам, решение которых связано с исследованиями в области Б. х., относятся:

Создание строго специфичных высокоактивных катализаторов (на основе изучения строения и механизма действия ферментов),

Прямое превращение химической энергии в механическую (на основе изучения мышечного сокращения),

Использование в технике химических принципов хранения и передачи информации, осуществляемых в биологических системах, принципов саморегулирования многокомпонентных систем клетки в первую очередь избирательной проницаемости биологических мембран, и многое др.

Перечисленные проблемы лежат далеко за пределами собственно Б. х.; однако она создает основные предпосылки для разработки этих проблем, обеспечивая главные опорные пункты для развития биохимических исследований, относящихся уже к области молекулярной биологии. Широта и важность решаемых проблем, разнообразие методов и тесная связь с другими научными дисциплинами обеспечили быстрое развитие Б. х.

Биоорганическая химия сформировалась в самостоятельную область в 50-х гг. 20 в.

В этот же период это направление начало делать первые шаги в Советском Союзе.

Заслуга в этом принадлежала академику Михаилу Михайловичу Шемякину.

Тогда ему оказали решительную поддержку руководители Академии наук А. Н. Несмеянов и Н. Н. Семенов, и уже в 1959 г. в системе АН СССР был создан базовый институт химии природных соединений АН СССР, который он возглавил с момента его создания (1959) до 1970 года. С 1970 по 1988 год, после смерти Михаила Михайловича Шемякина, институт возглавил его ученик и последователь академик Ю. А. Овчинников. «Развиваясь в недрах органической химии с самого начала ее зарождения как науки, она не только питалась и питается всеми представлениями органической химии, но и сама непрерывно обогащает последнюю новыми идеями, новым фактическим материалом принципиальной важности, новыми методами» – говорил академик, крупный ученый в области органической химии Михаил Михайлович Шемякин (1908-1970)»

В 1963 г. организовано Отделение биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединений АН СССР. Соратниками М. М. Шемякина в этой деятельности, а порой и борьбе, были академики А. Н. Белозерский и В. А. Энгельгардт; уже в 1965 г. Академик А. Н. Белозерский основал Межфакультетскую лабораторию биоорганической химии МГУ, которая сейчас носит его имя.

Методы и с с л е д о в а н и я: основной арсенал составляют методы органической химии, однако для решения структурно-функциональных задач привлекаются и разнообразные физические, физико-химические, математические и биологические методы.

Аминокислоты (аминокарбо́новые кисло́ты ) - являются бифункциональными соединениями, которые содержат в молекуле две реакционноспособные группы: карбонильные (–СООН), аминогруппу (–NH 2), α-атом углерода (в центре) и радикал (различается у всех α-аминокислот).

Аминокислоты могут рассматриваться как производные карбоновых кислот, в которых один или несколько атомов водорода заменены на аминные группы.

Аминокислоты (кроме глицина) существуют в двух стереоизомерных формах – L и D, вращающих плоскость поляризации света соответственно влево и вправо.

Все живые организмы синтезируют и усваивают только L-аминокислоты, а D-аминокислоты для них либо безразличны, либо вредны. В естественных белках встречаются преимущественно α-аминокислоты, в молекуле которых аминогруппа присоединена к первому атому (α-атому) углерода; у β-аминокислот аминогруппа находится при втором атоме углерода.

Аминокислоты являются мономерами, из которых строятся полимерные молекулы – протеины, или белки.

Как уже отмечалось ранее, практически все природные α-аминокислоты оптически активны (за исключением глицина) и относятся к L-ряду. Это означает, что в проекции Фишера, если внизу расположить заместитель, а вверху карбоксильную группу, то аминогруппа будет находиться слева.

Это, разумеется, не означает, что все природные аминокислоты вращают плоскость поляризованного света в одну и ту же сторону, поскольку направление вращения определяется свойствами всей молекулы, а не конфигурацией его асимметрического атома углерода. Большая часть природных аминокислот имеет S-конфигурацию (в том случае, когда в ее состав входит один асимметрический атом углерода).

Некоторые микроорганизмы синтезируют аминокислоты D-ряда. Такие аминокислоты называют “неприродными”.

Конфигурацию протеиногенных аминокислот соотносят с D - глюкозой; такой подход предложен Э. Фишером в 1891 г. В пространственных формулах Фишера заместители у хирального С-2 атома занимают положение, которое соответствует их абсолютной конфигурации (это было доказано через 60 лет).

На рисунке приведены пространственные формулы D- и L-аланина.

Все аминокислоты, за исключением глицина, оптически активны благодаря хиральному строению.

Энантиомерные формы, или-оптические антиподы, имеют различные показатели преломления (круговое двулучепреломление) и различные коэффициенты молярной экстинкции (круговой дихроизм) для лево и право циркулярно поляризованных компонент линейно-поляризованного света. Они поворачивают плоскость колебаний линейного поляризованного света на равные углы, но в противоположных направлениях. Вращение происходит так, что обе световые составляющие проходят оптически активную среду с различной скоростью и при этом сдвигаются по фазе.

По углу вращения а, определенному на поляриметре, можно определить удельное вращение [a] D.

ИЗОМЕРИЯ АМИНОКИСЛОТ

1)Изомерия углеродного скелета

доктор биологических наук, профессор В. М. Шкуматов ;

заместитель генерального директора по вопросам

инновационного развития РУП «Белмедпрепараты»

кандидат технических наук Т. В. Трухачева

Леонтьев, В. Н.

Химия биологически активных веществ: электронный курс текстов лекций для студентов специальности 1-48 02 01 «Биотехнология» очной и заочной форм обучения / В. Н. Леонтьев, О. С. Игнатовец. – Минск: БГТУ, 2013. – 129 с.

Электронный курс текстов лекций посвящен структурно-функциональным особенностям и химическим свойствам основных классов биологически активных веществ (белков, углеводов, липидов, витаминов, антибиотиков и др.). Описаны методы химического синтеза и структурного анализа перечисленных классов соединений, их свойства и воздействие на биологические системы, а также распространение в природе.

Тема 1. Введение
Химия биологически активных веществ изучает строение и биологические функции важнейших компонентов живой материи, в первую очередь биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов, уделяя осное внимание выяснению закономерностей взаимосвязи между структурой и биологическим действием. По существу, она является химическим фундаментом современной биологии. Разрабатывая основополагающие проблемы химии живого мира, биоорганическая химия способствует решению задач получения практически важных препаратов для медицины, сельского хозяйства, ряда отраслей промышленности.

Объекты изучения: белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, биополимеры смешанного типа – гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, гликолипиды и т. п.; алкалоиды, терпеноиды, витамины, антибиотики, гормоны, простагландины, ростовые вещества, феромоны, токсины, а также синтетические лекарственные препараты, пестициды и др.

Методы исследования: основной арсенал составляют методы органической химии, однако для решения структурно-функциональных задач привлекаются и разнообразные физические, физико-химические, математические и биологические методы.

Основные задачи: выделение в индивидуальном состоянии изучаемых соединений с помощью кристаллизации, перегонки, различных видов хроматографии, электрофореза, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования, противоточного распределения и т. п.; установление структуры, включая пространственное строение, на основе подходов органической и физико-органической химии с применением масс-спектрометрии , различных видов оптической спектроскопии (ИК, УФ, лазерной и др.), рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса, дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма, методов быстрой кинетики и т. п. в сочетании с расчетами на ЭВМ; химический синтез и химическая модификация изучаемых соединений, включая полный синтез, синтез аналогов и производных, – с целью подтверждения структуры, выяснения связи строения и биологической функции, получения практически ценных препаратов; биологическое тестирование полученных соединений in vitro и in vivo .

Наиболее часто встречающиеся в биомолекулах функциональные группы:

гидроксильная (спирты)	аминогруппа (амины)
альдегидная (альдегиды)	амидная (амиды)
карбонильная (кетоны)	сложно-эфирная
карбоксильная (кислоты)	эфирная
сульфгидрильная (тиолы)	метильная
дисульфидная	этильная
фосфатная	фенильная
гуанидиновая	имидазольная

Тема 2. Белки и пептиды . Первичная структура белков и пептидов
Белки – высокомолекулярные биополимеры, построенные из остатков аминокислот. Молекулярная масса белков колеблется в пределах от 6 000 до 2 000 000 Да. Именно белки являются продуктом генетической информации, передаваемой из поколения в поколение, и осуществляют все процессы жизнедеятельности в клетке. Этим удивительным по разнообразию полимерам присущи одни из наиболее важных и разносторонних клеточных функций.

Белки можно разделить:
1) по строению : простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются, соответственно, только на свободные аминокислоты или их производные.

Сложные белки – это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, образуются небелковая часть или продукты ее распада. В их состав могут входить ионы металлов (металлопротеины), молекулы пигментов (хромопротеины), они могут образовывать комплексы с другими молекулами (липо-, нуклео-, гликопротеины), а также ковалентно связывать неорганический фосфат (фосфопротеины);

2. растворимости в воде :

– водорастворимые,

– солерастворимые,

– спирторастворимые,

– нерастворимые;

3. выполняемым функциям : к биологическим функциям белков относятся:

– каталитическая (ферментативная),

– регуляторная (способность регулировать скорость химических реакций в клетке и уровень метаболизма в целом организме),

– транспортная (транспорт веществ в организме и перенос их через биомембраны),

– структурная (в составе хромосом, цитоскелета, соединительных, мышечных, опорных тканей),

– рецепторная (взаимодействие рецепторных молекул с внеклеточными компонентами и инициирование специфического клеточного ответа).

Кроме этого, белки выполняют защитные, запасные, токсические, сократительные и другие функции;

4) в зависимости от пространственной структуры:

– фибриллярные (они используются природой как структурный материал),

– глобулярные (ферменты, антитела, некоторые гормоны и др.).

АМИНОКИСЛОТЫ, ИХ СВОЙСТВА
Аминокислотами называются карбоновые кислоты, содержащие аминогруппу и карбоксильную группу. Природные аминокислоты являются 2-аминокарбоновыми кислотами, или α-аминокислотами, хотя существуют такие аминокислоты, как β-аланин, таурин, γ-аминомасляная кислота. В общем случае формула α-аминокислоты выглядит так:


У α-аминокислот при 2-м атоме углерода имеются четыре разных заместителя, т. е. все α-аминокислоты, кроме глицина, имеют асимметрический (хиральный) атом углерода и существуют в виде двух энантиомеров – L - и D -аминокислот. Природные аминокислоты относятся к L -ряду. D -аминокислоты встречаются в бактериях и пептидных антибиотиках.

Все аминокислоты в водных растворах могут существовать в виде биполярных ионов, причем их суммарный заряд зависит от рН среды. Величина рН, при которой суммарный заряд равен нулю, называется изоэлектрической точкой . В изоэлектрической точке аминокислота является цвиттер-ионом , т. е. аминная группа у нее протонирована, а карбоксильная – диссоциирована. В нейтральной области рН большинство аминокислот являются цвиттер-ионами:


Аминокислоты не поглощают свет в видимой области спектра, ароматические аминокислоты поглощают свет в УФ области спектра: триптофан и тирозин при 280 нм, фенилаланин при 260 нм.

Белки дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или общих химических группировок. Эти реакции широко используются для аналитических целей. Среди них наиболее известны нингидриновая реакция, позволяющая проводить количественное определение аминогрупп в белках, пептидах и аминокислотах, а также биуретовая реакция, применяемая для качественного и количественного определения белков и пептидов. При нагревании белка или пептида, но не аминокислоты, с CuSO 4 в щелочном растворе образуется окрашенное в фиолетовый цвет комплексное соединение меди, количество которого можно определить спектрофотометрически. Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи – при взаимодействии с а-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. Индольное кольцо триптофана может быть обнаружено реакцией Эрлиха – красно-фиолетовое окрашивание при реакции с п-диметиламино-бензальдегидом в H 2 SO 4 . Реакция Паули позволяет выявить остатки гистидина и тирозина, которые в щелочных растворах реагируют с диазобензол-сульфокислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет.

Биологическая роль аминокислот:

1) структурные элементы пептидов и белков, так называемые протеиногенные аминокислоты. В состав белков входят 20 аминокислот, которые кодируются генетическим кодом и включаются в белки в процессе трансляции, некоторые из них могут быть фосфорилированы, ацилированы или гидроксилированы;

2) структурные элементы других природных соединений – коферментов, желчных кислот, антибиотиков;

3) сигнальные молекулы. Некоторые из аминокислот являются нейромедиаторами или предшественниками нейромедиаторов, гормонов и гистогормонов;

4) важнейшие метаболиты, например, некоторые аминокислоты являются предшественниками алкалоидов растений, или служат донорами азота, или являются жизненно важными компонентами питания.

Номенклатура, молекулярная масса и значения pK аминокислот приведены в таблице 1.

Таблица 1
Номенклатура, молекулярная масса и значения pK аминокислот

Аминокислоты различаются по растворимости в воде. Это связано с их цвиттерионным характером, а также со способностью радикалов взаимодействовать с водой (гидратироваться). К гидрофильным относятся радикалы, содержащие катионные, анионные и полярные незаряженные функциональные группы. К гидрофобным – радикалы, содержащие алкильные или арильные группы.

В зависимости от полярности R -групп выделяют четыре класса аминокислот: неполярные, полярные незаряженные, отрицательно заряженные и положительно заряженные.

К неполярным аминокислотам относятся: глицин; аминокислоты с алкильными и арильными боковыми цепями – аланин, валин, лейцин, изолейцин; тирозин, триптофан, фенилаланин; иминокислота – пролин. Они стремятся попасть в гидрофобное окружение «внутри» молекулы белка (рис.1).

Рис. 1. Неполярные аминокислоты
К полярным заряженным аминокислотам относятся: положительно заряженные аминокислоты – гистидин, лизин, аргинин (рис. 2); отрицательно заряженные аминокислоты – аспарагиновая и глутаминовая кислота (рис. 3). Они обычно выступают наружу, в водное окружение белка.

Остальные аминокислоты образуют категорию полярных незаряженных: серин и треонин (аминокислоты-спирты); аспарагин и глутамин (амиды аспарагиновой и глутаминовой кислот); цистеин и метионин (серосодержащие аминокислоты).

Поскольку при нейтральном значении рН СООН-группы глутаминовой и аспарагиновой кислот полностью диссоциированы, их принято называть глутаматом и аспартатом независимо от природы присутствующих в среде катионов.

В ряде белков содержатся особые аминокислоты, образующиеся путем модификации обычных аминокислот после их включения в полипептидную цепь, например, 4-гидроксипролин, фосфосерин, -карбоксиглутаминовая кислота и др.

Рис. 2. Аминокислоты с заряженными боковыми группами
Все аминокислоты, образующиеся при гидролизе белков в достаточно мягких условиях, обнаруживают оптическую активность, т. е. способность вращать плоскость поляризованного света (за исключением глицина).

Рис. 3. Аминокислоты с заряженными боковыми группами
Оптической активностью обладают все соединения, способные существовать в двух стереоизомерных формах L- и D-изомеры (рис. 4). В состав белков входят только L -аминокислоты.

L -аланин D -аланин
Рис. 4. Оптические изомеры аланина

Глицин не имеет асимметрического атома углерода, а треонин и изолейцин содержат по два асимметрических атома углерода. Все остальные аминокислоты имеют один асимметрический атом углерода.

Оптически неактивная форма аминокислоты называется рацематом, представляющим собой эквимолярную смесь D - и L -изомеров, и обозначается символом DL -.

М

ономеры аминокислот, входящих в состав полипептидов, называются аминокислотными остатками. Остатки аминокислот соединяются друг с другом пептидной связью (рис. 5), в формировании которой принимает участие -карбоксильная группа одной аминокислоты и α-аминогруппа другой.
Рис. 5. Образование пептидной связи
Равновесие этой реакции сдвинуто в сторону образования свободных аминокислот, а не пептида. Поэтому биосинтез полипептидов требует катализа и затрат энергии.

Поскольку дипептид содержит реакционноспособные карбоксильную и аминогруппу, то к нему с помощью новых пептидных связей могут присоединяться другие аминокислотные остатки, в результате образуется полипептид – белок.

Полипептидная цепь состоит из регулярно повторяющихся участков – групп NHCHRCO, образующих основную цепь (скелет или остов молекулы), и вариабельной части, включающей характерные боковые цепи. R -группы аминокислотных остатков выступают из пептидного остова и формируют в значительной степени поверхность полимера, определяя многие физические и химические свойства белков. Свободное вращение в пептидном остове возможно между атомом азота пептидной группы и соседним -углеродным атомом, а также между -углеродным атомом и углеродом карбонильной группы. Благодаря этому линейная структура может приобретать более сложную пространственную конформацию.

Аминокислотный остаток, имеющий свободную -аминогруппу, называется N -концевым, а имеющий свободную -карбоксильную группу – С -концевым.

Структуру пептидов принято изображать с N -конца.

Иногда концевые -амино- и -карбоксильная группы связываются одна с другой, образуя циклические пептиды.

Пептиды различаются количеством аминокислот, аминокислотным составом и порядком соединения аминокислот.

Пептидные связи очень прочные, и для их химического гидролиза требуются жесткие условия: высокие температура и давление, кислая среда и длительное время.

В живой клетке пептидные связи могут разрываться с помощью протеолитических ферментов, называемых протеазами , или пептидгидролазами.

Так же, как и аминокислоты, белки являются амфотерными соединениями и в водных растворах заряжены. Для каждого белка существует своя изоэлектрическая точка – значение рН, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью скомпенсированы и суммарный заряд молекулы равен нулю. При значениях рН выше изоэлектрической точки белок несет отрицательный заряд, а при значениях рН ниже изоэлектрической точки – положительный.
СЕКВЕНАТОРЫ. СТРАТЕГИЯ И ТАКТИКА АНАЛИЗА ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence –последовательность).

Принципиально первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода. Естественно, наибольшую надежность обеспечивает сочетание этих методов.

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность в полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом, определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:

1) расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования;

2) секвенирование каждого из полученных фрагментов;

3) сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Исследование первичной структуры белка состоит из следующих стадий:

– определение его молекулярной массы;

– определение удельного аминокислотного состава (АК-состава);

– определение N - и С -концевых аминокислотных остатков;

– расщепление полипептидной цепи на фрагменты;

– расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом;

– разделение полученных фрагментов;

– аминокислотный анализ каждого фрагмента;

– установление первичной структуры полипептида с учетом перекрывающихся последовательностей фрагментов обоих расщеплений.

Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

1. Определение молекулярной массы (нижеперечисленные методы подробно рассмотрены в теме 3):

– по вязкости;

– по скорости седиментации (метод ультрацентрифугирования);

– гельхроматография;

– электрофорез в ПААГ в диссоциирующих условиях.

2. Определение АК-состава. Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 6 н. соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 150°С в течение 6 ч. Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора.

3. Определение N- и С-аминокислотных остатков. В полипептидной цепи белка с одной стороны расположен аминокислотный остаток, несущий свободную α-аминогруппу (амино- или N -концевой остаток), а с другой – остаток со свободной α-карбоксильной группой (карбоксильный, или С -концевой остаток). Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность оценить число полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и степень гомогенности исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N -концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Реакции определения N-концевых аминокислотных остатков:

1) один из первых методов определения N -концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сенгером в 1945 г. При реакции α- аминогруппы пептида или белка с 2,4-динитрофторбензолом получается динитрофенильное (ДНФ) производное, окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз (5,7 н. НСl) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производного N -концевой аминокислоты. ДНФ-аминокислота экстрагируется эфиром и идентифицируется хроматографическим методом в присутствии стандартов.

2) метод дансилирования. Наибольшее применение для определения N -концевых остатков в настоящее время находит разработанный в 1963 г. В. Греем и Б. Хартли дансильный метод. Как и метод динитрофенилирования, основан на введении в аминогруппы белка «метки», не удаляющейся при последующем гидролизе. Его первая стадия – реакция дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) с непротонированной а-амино-группой пептида или белка с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). На следующей стадии ДНС-пептид гидролизуется (5,7 н. НС1, 105°С, 12 - 16 ч) и освобождается N -концевая α-ДНС-аминокислота. ДНС-аминокислоты обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра (365 нм); обычно для их идентификации достаточно 0,1 - 0,5 нмоль вещества.

Имеется ряд методов, с помощью которых можно определять как N -концевой аминокислотный остаток, так и аминокислотную последовательность. К ним относятся деградация по методу Эдмана и ферментативный гидролиз аминопептидазами. Эти методы будут подробно рассмотрены ниже при описании аминокислотной последовательности пептидов.

Реакции определения С-концевых аминокислотных остатков:

1) среди химических методов определения С -концевых аминокислотных остатков заслуживают внимания метод гидразинолиза, предложенный С. Акабори, и оксазолоновый. В первом из них при нагревании пептида или белка с безводным гидразином при 100 - 120°С пептидные связи гидролизуются с образованием гидразидов аминокислот. С -концевая аминокислота остается в виде свободной аминокислоты и может быть выделена из реакционной смеси и идентифицирована (рис. 6).

Рис. 6. Расщепление пептидной связи гидразином
Метод имеет ряд ограничений. При гидразинолизе разрушаются глутамин, аспарагин, цистеин и цистин; аргинин теряет гуанидиновую группировку с образованием орнитина. Гидразиды серина, треонина и глицина лабильны и легко превращаются в свободные аминокислоты, что затрудняет интерпретацию результатов;

2) оксазолоновый метод, часто называемый методом тритиевой метки, основан на способности С -концевого аминокислотного остатка под действием уксусного ангидрида подвергаться циклизации с образованием оксазолона. В щелочных условиях резко увеличивается подвижность атомов водорода в положении 4 оксазолонового кольца и они могут быть легко заменена тритием. Образующиеся в результате последующего кислотного гидролиза тритиированного пептида или белка продукты реакции содержат радиоактивно меченную С -концевую аминокислоту. Хроматографирование гидролизата и измерение радиоактивности позволяют идентифицировать С -концевую аминокислоту пептида или белка;

3) чаще всего для определения С -концевых аминокислотных остатков используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, позволяющий анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность. Карбоксипептидаза гидролизует только те пептидные связи, которые образованы С -концевой аминокислотой, имеющей свободную α-карбоксильную группу. Поэтому под действием этого фермента от пептида последовательно отщепляются аминокислоты, начиная с С -концевой. Это позволяет определить взаимное расположение чередующихся аминокислотных остатков.

В результате идентификации N - и С -концевых остатков полипептида получают две важных реперных точки для определения его аминокислотной последовательности (первичной структуры).

4. Фрагментация полипептидной цепи.

Ферментативные методы. Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина. Также при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназа, которая также относится к классу сериновых протеиназ. Фермент имеет два максимума протеолитической активности при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

В распоряжении исследователей имеется также большой набор менее специфичных протеолитических ферментов (пепсин, эластаза, субтилизин, папаин, проназа и др.). Эти ферменты используются в основном при дополнительной фрагментации пептидов. Их субстратная специфичность определяется природой аминокислотных остатков , не только образующих гидролизуемую связь, но и более удаленных по цепи.

Химические методы.

1) среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромцианом по остаткам метионина (рис 7).

Реакция с бромцианом проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи. Получающийся на С -конце пептидов лактон гомосерина далее частично гидролизуется до гомосерина (HSer), в результате чего каждый пептидный фрагмент, за исключением С -концевого, существует в двух формах – гомосериновой и гомосеринлактоновой;

Рис. 7. Расщепление полипептидной цепи бромцианом
2) большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N -бромсукцинимид;

3) реакция тиолдисульфидного обмена. В качестве реагентов используют восстановленный глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол.

5. Определение последовательности пептидных фрагментов. На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на предыдущей стадии. Для этой цели обычно используют химический метод, разработанный Пером Эдманом. Расщепление по Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только N -концевой остаток пептида, а все остальные пептидные связи не затрагиваются. После идентификации отщепленного N -концевого остатка метка вводится в следующий, ставший теперь N -концевым, остаток, который точно так же отщепляется, проходя через ту же серию реакций. Так, отщепляя остаток за остатком, можно определить всю аминокислотную последовательность пептида, используя для этой цели всего одну пробу. В методе Эдмана вначале пептид взаимодействует с фенилизотиоционатом, который присоединяется к свободной α-аминогруппе N -концевого остатка. Обработка пептида холодной разбовленной кислотой приводит к отщеплению N -концевого остатка в виде фенилтиогидантоинового производного, которое можно идентифицировать хроматографическими методами. Остальная часть пептидной цени после удаления N -концевого остатка оказывается неповрежденной. Операция повторяется столько раз, сколько остатков содержит пептид. Таким способом можно легко определить аминокислотную последовательность пептидов, содержащих 10 - 20 аминокислотных остатков. Определение аминокислотной последовательности проводится для всех фрагментов, образовавшихся при расщеплении. После этого возникает следующая проблема – определить, в каком порядке располагались фрагменты в первоначальной полипептидной цепи.

Автоматическое определение аминокислотной последовательности . Крупным достижением в области структурных исследований белков явилось создание в 1967 г. П. Эдманом и Дж. Бэггом секвенатора – прибора, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматическое отщепление N -концевых аминокислотных остатков по методу Эдмана. В современных секвенаторах реализованы различные методы определения аминокислотной последовательности.

6. Расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом. Чтобы установить порядок расположения образовавшихся пептидных фрагментов, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи, устойчивые к действию предыдущего реагента. Каждый из полученных коротких пептидов подвергается последовательному расщеплению по методу Эдмана (так же, как на предыдущей стадии), и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность.

7. Установление первичной структуры полипептида с учетом перекрывающихся последовательностей фрагментов обоих расщеплений. Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.

Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, для того чтобы найти перекрывающиеся участки для всех пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а иногда и четвертый способ расщепления, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих полное перекрывание всех участков и установление полной последовательности аминокислот в исходной полипептидной цепи.